RERT-lncRNA中插入缺失多態(tài)與肝細(xì)胞肝癌易感性關(guān)聯(lián)研究及功能分析.pdf

1、目的：研究RAB4B-EGLN2通讀長鏈非編碼RNA中的一個(gè)功能性插入/缺失多態(tài)（rs10680577）與中國人群肝細(xì)胞肝癌（HCC）易感性的關(guān)聯(lián)，并利用基因型-表型關(guān)聯(lián)研究及分子生物學(xué)方法探討該多態(tài)參與肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的功能及意義。
　　方法：（1）運(yùn)用生物信息學(xué)工具查找出RAB4B-EGLN2通讀中的多態(tài)，并從中選取一個(gè)具有潛在功能的四堿基插入/缺失(Indel)多態(tài)基因座（rs10680577）作為候選多態(tài)；（2）采用病例對照

2、研究方法（1067HCC病例和1692正常對照），PCR擴(kuò)增結(jié)合非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對候選多態(tài)進(jìn)行基因分型，Logistic回歸統(tǒng)計(jì)分析基因多態(tài)基因座與HCC的關(guān)聯(lián)性；（3）運(yùn)用Realtime PCR和Western blot研究肝細(xì)胞肝癌組織和五種肝細(xì)胞株（HepG2,Hep3B,SMMC7721,SK-Hep-1,L02）中rs10680577多態(tài)與EGLN2表達(dá)量的基因型-表型關(guān)聯(lián)；（4）構(gòu)建EGLN2啟動子報(bào)告質(zhì)粒導(dǎo)入

3、五種肝細(xì)胞株做雙熒光素酶報(bào)告基因測試的方法檢測其是否通過影響啟動子而發(fā)生調(diào)節(jié)作用；（5）考慮到基因座所處位置，利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測rs10680577多態(tài)基因座對RAB4B-EGLN2通讀長鏈非編碼RNA（RAB4B-EGLN2 readthrough long non coding RNA, RERT-lncRNA）折疊二級結(jié)構(gòu)的影響;（6）構(gòu)建RERT-lncRNA-pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體并瞬轉(zhuǎn)入三種肝癌細(xì)胞株（He

4、pG2, SMMC-7721和sk-Hep-1）檢測RERT-lncRNA和EGLN2 mRNA的方法進(jìn)行功能性驗(yàn)證。
　　結(jié)果：（1）基因分型結(jié)果顯示，位于RAB4B-EGLN2通讀內(nèi)的rs10680577基因座具有較好的多態(tài)性，病例組中rs10680577基因座4-bp插入(Ins)和4-bp缺失(Del)的等位基因頻率分別為0.759,0.241;正常組則分別為0.819,0.181。病例組和對照組中rs10680577基因

5、座的等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。調(diào)整性別、年齡、吸煙、飲酒、HBV感染等主要風(fēng)險(xiǎn)因素后，運(yùn)用Logistic回歸分析的方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與4-bpIns/Ins純合子相比，4-bpDel/Del純合子個(gè)體HCC易感性明顯增高（OR=2.32，95% C.I.:1.54-3.49, P<0.0001）；等位基因水平分析顯示，與Ins等位基因相比，攜帶Del等位基因的個(gè)體患

6、HCC的風(fēng)險(xiǎn)亦明顯增高（OR=1.44，95%C.I.:1.26-1.64，P<0.001）。吸煙狀態(tài)的分層分析發(fā)現(xiàn)，這種陽性關(guān)聯(lián)在重度吸煙人群中更顯著（Heterogeneity P=0.0002）；（2）rs10680577基因座與EGLN2的基因型-表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示， Del/Del和Ins/Del基因型組肝癌組織中EGLN2 mRNA的表達(dá)較Ins/Ins基因型組明顯增高，而鄰近的RAB4B mRNA則無明顯變化。在四種肝癌

7、細(xì)胞株和一種肝細(xì)胞株中，攜帶Del/Del基因型的Hep3B細(xì)胞株中EGLN2 mRNA的表達(dá)也比攜帶Ins/Ins基因型的HepG2，sk-Hep-1，SMMC-7721和L02四種細(xì)胞株明顯增高。Western blot結(jié)果顯示攜帶Del/Del基因型的肝癌細(xì)胞和組織EGLN2蛋白均比攜帶Ins/Del和Ins/Ins基因型的細(xì)胞和組織增高;（3）構(gòu)建包含rs10680577插入和缺失等位基因的EGLN2啟動子的兩種質(zhì)粒，雙熒光素酶

8、報(bào)告基因測試結(jié)果顯示，導(dǎo)入五種細(xì)胞株中的兩種質(zhì)粒表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別;（4）生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果提示，rs10680577多態(tài)可使RAB4B-EGLN2通讀長鏈非編碼RNA的空間構(gòu)象存在差別。肝癌細(xì)胞和組織中EGLN2和RERT-lncRNA的表達(dá)呈強(qiáng)相關(guān)(分別為R2=0.823, P=0.034與 R2=0.540, P<0.001)，而且攜帶缺失等位基因RERT-lncRNA的表達(dá)比不攜帶缺失等位基因顯著增高;（5）構(gòu)建包含rs106

9、80577插入等位基因的RERT-lncRNA pcDNA3.1(+)表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒并導(dǎo)入HepG2，SMMC-7721和sk-Hep-1三種細(xì)胞株，RERT-lncRNA升高4.73-9.82倍，EGLN2升高1.61-1.75倍。
　　結(jié)論：（1）中國人群中rs10680577多態(tài)與肝細(xì)胞肝癌易感性存在顯著關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)在重度吸煙患者中更為明顯；（2）肝癌組織中EGLN2的表達(dá)量與rs10680577多態(tài)之間存在顯著的基因型