打靶于CREPT的microRNA的篩選及功能研究.pdf

1、miRNAs是一類內(nèi)源性的RNA，是一系列短的、由20-22個核苷酸組成的非編碼的核酸，可以通過影響靶mRNA穩(wěn)定性或者翻譯過程，進而對轉(zhuǎn)錄后靶基因表達進行調(diào)節(jié)，與腫瘤細胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移以及凋亡有著至關重要的關系。miRNAs靶向作用于腫瘤相關基因，可抑制腫瘤細胞的生長、促進其衰老、抑制腫瘤細胞的增殖等。CREPT是新發(fā)現(xiàn)一種癌基因，其在多種腫瘤組織中存在高表達，有望成為新的治療靶點。然而，關于CREPT早期研究僅集中于該蛋白在腫瘤

2、發(fā)生、發(fā)展過程中對下游基因調(diào)控機制的研究和蛋白晶體結構的揭示，側重于CREPT蛋白下游生物學功能探討，而CREPT基因本身表達水平在腫瘤組織中升高的分子機制尚不清楚。
　　本實驗以人類結直腸癌細胞株中CREPT mRNA分子為治療靶點，通過Target Scan和miRanda等打靶軟件預測靶向于CREPT mRNA的miRNAs，并通過查閱文獻和相關數(shù)據(jù)庫及相關實驗，篩選出打靶于CREPT mRNA的miRNA，即為miR-19

3、4。通過雙熒光酶素報告基因表達活性檢測實驗檢測出miR-194與CREPT mRNA3’-UTR的精確結合位點，并用Western Blot實驗，研究了miR-194對CREPT蛋白水平表達，進一步驗證篩選結果。
　　通過細胞計數(shù)法、MTT法、克隆形成實驗，系統(tǒng)研究了miR-194對結直腸癌細胞HCT116β/W生長、增殖、克隆形成能力的影響。通過流式細胞儀檢測，對miR-194對細胞周期的影響進行探究。結果表明，miR-194打

4、靶于CREPT后，可以抑制HCT116β/W生長和增殖，調(diào)控細胞周期，使細胞阻滯于S期。通過Western Blot實驗，研究miR-194對細胞周期及對信號通路的影響。結果顯示，miR-194靶向于CREPT后，對Wnt信號通路有一定的抑制作用。miR-194打靶于CREPT后，可調(diào)節(jié)CREPT下游靶標基因，CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin E、C-myc周期相關蛋白表達降低，調(diào)控細胞周期。NF-κB p65蛋白表