馬氏珠母貝外套膜不同區(qū)域差異microRNA的篩選和功能研究.pdf

1、外套膜是貝殼形成的重要器官，按照不同部位結(jié)構(gòu)特征和功能的不同，外套膜從殼項(xiàng)向殼低方向大致可以分為三個(gè)區(qū)域:邊緣膜區(qū)(marginalzone)、套膜區(qū)(pallialzone)、中央膜區(qū)(centralzone)。一般認(rèn)為，邊緣膜區(qū)主要參與棱柱層的形成，套膜區(qū)和中央膜區(qū)主要參與珍珠層的形成。為了探究外套膜中央膜與邊緣膜功能上的差異機(jī)制，課題組前期的研究中構(gòu)建了馬氏珠母貝中央膜與邊緣膜mRNA和miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，本研究以此為基礎(chǔ)，篩

2、選中央膜和邊緣膜差異表達(dá)的miRNA，隨后通過mir-RACE技術(shù)驗(yàn)證篩選miRNA的序列，利用莖環(huán)引物熒光定量技術(shù)檢測篩選miRNA的組織表達(dá)差異。通過生物信息學(xué)分析篩選miRNA的靶點(diǎn)，并使用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA與預(yù)測靶基因間的靶向關(guān)系。最后通過體內(nèi)miRNA過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合莖環(huán)引物熒光定量和掃描電鏡觀察，檢測miRNA對(duì)貝殼內(nèi)表面結(jié)構(gòu)及靶基因表達(dá)的影響，以此鑒定miRNA的功能及調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.

3、miRNA的篩選和鑒定:通過分析馬氏珠母貝外套膜中央膜與邊緣膜miRNA數(shù)據(jù)，從189條已知miRNA中分別篩選出3個(gè)邊緣膜高表達(dá)的miRNA(miR-124、miR-8-3p、miR-9a-5p)和2個(gè)中央膜高表達(dá)的miRNA(miR-10a-3p、miR-183)。通過mir-RACE技術(shù)對(duì)上述5個(gè)miRNA進(jìn)行了序列驗(yàn)證，結(jié)果表明miR-124、miR-8-3p、miR-9a-5p和miR-183的序列同測序結(jié)果相同，miR-10

4、a-3p序列同測序結(jié)果相比3'端缺少一個(gè)堿基(T)。利用莖環(huán)引物熒光定量技術(shù)對(duì)5個(gè)miRNA在邊緣膜和中央膜的表達(dá)情況進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示miRNA在中央膜和邊緣膜的表達(dá)趨勢與預(yù)測結(jié)果一致。
　　2.miRNA的功能研究:通過掃描電鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)miR-9a-5p、miR-10a-3p和miR-124過表達(dá)時(shí)，貝殼珍珠層的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的紊亂，表明miR-9a-5p、miR-10a-3p和miR-124參與調(diào)控馬氏珠母貝珍

5、珠層的形成。
　　3.miRNA靶基因的預(yù)測及靶向關(guān)系驗(yàn)證:通過靶基因預(yù)測軟件(RNAhybrid和miRanda)，結(jié)合外套膜中央膜和邊緣膜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)miRNA與其靶基因表達(dá)互補(bǔ)原則，預(yù)測miRNA的靶向調(diào)控基因。最終獲得4個(gè)與馬氏珠母貝免疫、生長或礦化相關(guān)的基因作為篩選miRNAs的靶點(diǎn)，其中miR-10a-3p的預(yù)測靶點(diǎn)為:nAChRsα、NPY和PfCHS1;miR-124的預(yù)測靶點(diǎn)為:nAChRsα、NPY和Pf

6、CHS1; miR-9a-5p的預(yù)測靶點(diǎn)為:TRAF2和PfCHS1。miRNA過表達(dá)后通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn)miR-9a-5p過表達(dá)可以降低PfCHS1基因的表達(dá)，miR-10a-3p過表達(dá)可以降低NPY基因的表達(dá)，進(jìn)一步說明miR-9a-5p和PfCHS1p之間，miR-10a-3p和NPY之間存在靶向調(diào)控關(guān)系，同時(shí)也說明miR-9a-5p可能通過調(diào)控PfCHS1的表達(dá)，miR-10a-3p通過調(diào)控NPY的表達(dá)參與調(diào)控馬氏珠母貝貝殼的