淇河鯽CYP19基因的克隆、表達模式分析及免疫組化定位.pdf

1、與高等脊推動物相比，魚類的性腺在胚胎發(fā)育早期更明顯地表現(xiàn)為雙向分化潛能，各種外部環(huán)境因素都可能在不同程度上影響魚類的性別分化。目前內(nèi)源性類固醇激素在魚類性腺分化中的重要作用已被普遍認同，芳香化酶作為魚類體內(nèi)雌激素生物合成的關(guān)鍵酶和限速酶，該酶基因(CYP19)的表達與調(diào)控顯然在魚類性別決定與分化的分子機制中起著重要的作用。 淇河鯽是產(chǎn)于豫北淇河的中國地方性銀鯽種群，具有天然的三倍染色體系統(tǒng)和雌核發(fā)育繁殖方式，自然群體中存在著極少

2、數(shù)的雄性個體，且雄性個體具有正常的生精能力。因此，淇河鯽是典型的雌核發(fā)育兩性型種群。本研究通過對淇河鯽的性激素代謝基因——芳香化酶基因的克隆、時空表達與性腺細胞學定位的研究，從分子和細胞水平上探討了這一雌核發(fā)育兩性型種群性別分化的機制。 利用RT-PCR和3′-RACE技術(shù)，在淇河鯽卵巢和腦中分別克隆得到兩種不同類型CYP19 cDNA序列片段，其中CYP19a cDNA克隆片段長1468bp，含有240bp 3′-非翻譯區(qū)，編

3、碼409個氨基酸殘基；CYP19b cDNA克隆片段長2671bp，含有1385bp 3′-UTR，編碼428個氨基酸殘基；兩種CYP19 cDNA序列之間同源性為64.65％，氨基酸序列同源性為62.88％。系統(tǒng)進化顯示，淇河鯽CYP19氨基酸序列分屬于魚類卵巢和腦芳香化酶基因的分支，與金魚的同源性最高。 以β-actin為內(nèi)參照，采用半定量RT-PCR方法檢測兩種CYP19基因在淇河鯽成體周年發(fā)育過程的三個時期(繁殖期、性腺

4、退化期、越冬期)五種組織(精巢、卵巢、腦、腎、肝)中的表達模式以及在胚胎發(fā)育過程七個階段(囊胚期、原腸胚、神經(jīng)胚、尾芽期、肌肉效應期、孵出期、卵黃吸收期)的表達。結(jié)果顯示，兩種CYP19基因的表達模式有所不同。在繁殖期的各組織中CYP19均有表達，且表達活性卵巢≈腦>肝>精巢>腎；性腺退化期的肝、腎中均未見表達，其余三個組織的表達活性卵巢>腦>精巢；越冬期也僅在三個組織中有表達，表達活性精巢>卵巢>肝。CYP19b在繁殖期的表達活性最高

5、，除了腎其余四個組織中均有表達，且表達活性腦>卵巢>肝>精巢：性腺退化期與越冬期則僅見腦中有高表達。但總的來看，CYP19a主要表達于性腺組織(精巢和卵巢)中，CYP19b則主要表達于腦組織中。CYP19a從胚胎尾芽期出現(xiàn)，后呈遞增表達；CYP19b基因則至卵黃吸收期有突然的強表達。 SABC法對周年發(fā)育不同階段卵巢和精巢進行的芳香化酶免疫細胞定位顯示，芳香化酶在卵巢的濾泡細胞、卵被膜、胞質(zhì)、核膜以及精巢的生殖細胞、間質(zhì)細胞和足