稀有鮈鯽和泥鰍部分基因的克隆及其表達模式.pdf

1、本項目以稀有鮈鯽和泥鰍為對象，克隆了稀有鮈鯽和泥鰍的肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)基因，并對其表達模式進行了初步研究；同時，克隆了稀有鮈鯽β-肌動蛋白基因，為進一步研究魚類肌肉生長發(fā)育調(diào)節(jié)機制下了基礎(chǔ)。 肌肉生長抑制素是轉(zhuǎn)化生長因子β家族成員之一，是動物肌肉生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，抑制肌肉的發(fā)育和生長。魚類MSTN的研究將有助于了解肌肉發(fā)育及其調(diào)控機理，促進漁業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展。 1．以稀有鮈鯽為主要研究對象，通

2、過RT-PCR和RACE的方法，從稀有鮈鯽肌肉組織的SMARTcDNA文庫中克隆出MSTN全長基因．與其它已知的MSTN比對，同源性非常高，達54％-97％，并基于已知的MSTN氨基酸系列構(gòu)建了進化樹。稀有鮈鯽的MSZN基因的cDNA全長2184bp，含有1128bp的開放閱讀框，編碼375個氨基酸。分析表明，其蛋白質(zhì)具有兩個典型的TGF-β蛋白結(jié)構(gòu)域，一個是TGF-β前肽結(jié)構(gòu)域；從第99位到第255位，共157個氨基酸。另一個是TGF

3、-β結(jié)構(gòu)域，是TGF-β家族基因的活性結(jié)構(gòu)域，從第281位至第375位，共95個氨基酸。稀有鮈鯽的MSTN蛋白具有典型的RXXR蛋白酶水解位點(RIRR)，位于第263-266位；另有9個保守的半胱氨酸殘基。信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于分泌性蛋白。采用RT-PCR方法進行了稀有鮈鯽MSTN基因的時空表達模式特征分析，結(jié)果表明，稀有鮈鯽MSTN在肌肉和眼睛中表達；而在其他被檢測的部位如：腦、鰓、心臟、腸、卵巢、肝、精巢中未檢測到。說明魚類MS

4、TN基因可能除了抑制肌肉生長發(fā)育以外，對眼的發(fā)育也有一定的作用。 2．以泥鰍肌肉cDNA為模板，采用RT-PCR方法克隆了泥鰍MSTN基因的主要片段：其長度為815bp，編碼271個氨基酸殘基?？寺〉哪圉qMSTN基因已近完整的閱讀框架(ORF)，包含了MSTN前肽結(jié)構(gòu)域、MSTN功能結(jié)構(gòu)域、保守的蛋白酶水解位點RIRR和7個保守的半胱氨酸殘基等主要功能片段。泥鰍MSTN與鯉MSTN同源性高達94％，與斑馬魚MSTN同源性達92％

5、。不同組織的RT-PCR分析表明該基因在肌肉中強烈表達，在眼中也有微弱表達，而在其他所檢測組織(腦、鰓、心臟、肝臟、腸、精巢、卵巢)中未見表達。與稀有鮈鯽MSTN的表達模式一致。 3．β-actin基因是真核生物中普遍存在，是進化中高度保守的蛋白質(zhì)家族，與一些管家基因一樣，在物種內(nèi)持續(xù)恒量表達，因而在很多需量化的實驗技術(shù)，如RT-PCR、PCR、Northern雜交中被當(dāng)作內(nèi)參照。本研究采用RT-PCR方法從稀有鮈鯽肌肉組織中分