稀有鮈鯽β-actin啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在熒光稀有鮈鯽培育上的應(yīng)用.pdf

1、稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)是我國(guó)特有的一種小型鯉科魚類，并已作為一種新型的模式實(shí)驗(yàn)魚應(yīng)用于魚病學(xué)、遺傳學(xué)、環(huán)境科學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域。其所具有的優(yōu)良特性使其具備通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)開發(fā)培育類似于斑馬魚（Danio rer io）、青鳉（Oryzias latipes）等觀賞魚的潛在可能性。β肌動(dòng)蛋白(β-actin)是主要的胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白，目前已成功分離了多種魚類的β-actin基因啟動(dòng)子，并在轉(zhuǎn)基因魚的應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)

2、的轉(zhuǎn)錄活性。本實(shí)驗(yàn)以稀有鮈鯽為對(duì)象，旨在分離其具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)片段，并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因熒光稀有鮈鯽，主要的研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.本研究使用4種化學(xué)脫粘劑對(duì)稀有鮈鯽的粘性受精卵進(jìn)行脫粘處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5％Na2SO3+0.2％木瓜酶的化學(xué)脫粘劑能快速脫去稀有鮈鯽粘性受精卵的粘性，且不影響胚胎正常發(fā)育，.是顯微注射等后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作的首選。
　　 2.采用PCR方法，從稀有鮈鯽基因組DNA中分離得到大小為1584bp的β肌

3、動(dòng)蛋白(β-actin)基因片段。序列分析表明，該片段包括長(zhǎng)為1507bp的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)和77bp的部分轉(zhuǎn)錄區(qū)序列。啟動(dòng)調(diào)控區(qū)包括一段長(zhǎng)為109bpβ-actin基因上游調(diào)控序列，不翻譯的外顯子1和內(nèi)含子1。上游調(diào)控序列中含有TATA box，CAATbox和CArG box等與轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)的作用元件，并且在稀有鮈鯽β-actin基因第一個(gè)內(nèi)含子中也含有一個(gè)CArG調(diào)控元件。
　　 3.將分離得到的啟動(dòng)子片段克隆到綠色熒光表達(dá)

4、載體(pAcGFPl-1)上，得到重組質(zhì)粒β-actin-AcGFPl。通過顯微注射將線性化的重組表達(dá)載體導(dǎo)入經(jīng)1.5％Na2SO3+0.2％木瓜酶脫粘的稀有鮈鯽受精卵中，利用熒光顯微鏡能觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，其中陽(yáng)性率最高為7.69％，表明所分離的稀有鮈鯽β-actin基因啟動(dòng)子片段具有一定的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 4.采用基因組步移(Genome Walker)技術(shù)，根據(jù)已克隆得到的1584 bp的稀有鮈鯽β肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子

5、序列，進(jìn)一步得到5'上游1704bp的側(cè)翼序列。對(duì)其進(jìn)行序列分析表明，該片段中包含MyoD、USF、YY1、Sp1、MEF-2等多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。將該序列同其他鯉科魚類進(jìn)行在線比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-110bp至-175bp處的序列具有較高的相似性，其中可能還包含有2個(gè)USF位點(diǎn)和1個(gè)E-box。以稀有鮈鯽基因組DNA為模板，根據(jù)所得片段和已克隆的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)一步獲得了稀有鮈鯽β-actin基因啟動(dòng)調(diào)控序列。