稀有鮈鯽microRNA的鑒定及在水生態(tài)毒理學(xué)上的初步應(yīng)用.pdf

1、MicroRNAs（miRNAs）是一類(lèi)重要的內(nèi)源性短的（～22個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度）單鏈非編碼RNA(ncRNA)，存在于動(dòng)物、植物等真核生物以及某些病毒中，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老及代謝等生物體內(nèi)的多個(gè)生理生化過(guò)程。研究顯示，miRNAs的異常表達(dá)與許多人類(lèi)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。雖然已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了PAHs對(duì)人類(lèi)健康的危害，但大部分工作還主要集中在對(duì)高分子量PAHs的研究上，忽略了低分子量PAHs的環(huán)境危害。
　　稀有鮈鯽

2、(Gobiocypris rarus)是中國(guó)一種小型鯉科土著魚(yú)類(lèi)，已被廣泛用作水生實(shí)驗(yàn)用魚(yú)。鑒定稀有觴鯽的miRNAs基因信息是發(fā)現(xiàn)miRNA的生物學(xué)功能和篩選新的分子生物標(biāo)志物，以評(píng)估未來(lái)環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)的第一步。然而，稀有鮈鯽的相關(guān)生物學(xué)數(shù)據(jù)如miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并沒(méi)有獲得。
　　本研究借助Illunima高通量測(cè)序技術(shù)獲取了稀有鮈鯽的miRNAs生物學(xué)信息。以菲(Phenanthrene，Phe)為例，研究了成年稀有鮈鯽（～5

3、個(gè)月）在濃度為10μg/L、100μg/L、1000μg/L的Phe溶液中暴露30d后的肝臟毒性效應(yīng)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了一個(gè)從稀有鮈鯽6個(gè)不同組織（腦、眼、肝臟、鰓、肌肉和心）中提取的等量RNA構(gòu)成的混合文庫(kù)，并通過(guò)illumina高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，共獲得26，930，553個(gè)原始序列和2，118，439個(gè)高質(zhì)量序列。通過(guò)生物信息學(xué)分析首次在稀有鮈鯽中發(fā)現(xiàn)并注釋了352個(gè)保守的以及112個(gè)候選的新

4、miRNAs。
　　2.對(duì)Phe處理組的稀有鮈鯽肝臟組織進(jìn)行TUNEL和Hoechst33342染色，染色結(jié)果均顯示隨著暴露濃度的升高，肝臟細(xì)胞凋亡數(shù)目也隨之增加，其中10μg/L和100μg/L的處理濃度顯著誘導(dǎo)了肝臟細(xì)胞的凋亡發(fā)生。此外還發(fā)現(xiàn)caspase3酶活性在10μg/L和100μg/L的處理組顯著上升，caspase9的活性?xún)H在1000μg/L的處理組中顯著上調(diào)(P＜0.05），caspase8各濃度處理組均無(wú)顯著上調(diào)

5、。綜合上述組織學(xué)染色和細(xì)胞凋亡過(guò)程中caspase3、caspase8和caspase9酶活性的試驗(yàn)結(jié)果表明，Phe通過(guò)caspase9介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑引起了稀有鮈鯽肝臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　3.采用qPCR法檢測(cè)p53信號(hào)通路中的細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因在稀有鮈鯽肝臟中的表達(dá)情況。細(xì)胞周期調(diào)控基因p21和gadd45α的表達(dá)量在各濃度組均顯著上調(diào)(P＜0.05)，其中10μg/L和100μg/L的處理組與對(duì)照組相比上調(diào)倍數(shù)均

6、10倍以上。抗細(xì)胞凋亡基因bcl-2表達(dá)量在100μg/L和1000μg/L濃度組沒(méi)有顯著變化，而10μg/L濃度組基因表達(dá)量明顯增加(P＜0.05）。與對(duì)照組相比，促凋亡基因bax的表達(dá)情況正好與bcl-2相反，在高濃度組(100μg/L和1000μg/L)顯著誘導(dǎo)(P＜0.05)。
　　4.采用poly(A)加尾法測(cè)定了Phe對(duì)稀有鮈鯽肝臟miR-17～92 cluster(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR