石蠟切片免疫組化步驟

1、石蠟切片免疫組化步驟1.石蠟切片放置在60℃恒溫箱中烘烤120分鐘。2.脫蠟和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→無水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修復(fù)：檸檬酸鈉緩沖液95度，10分鐘.(枸櫞酸三鈉3g枸櫞酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI調(diào)pH值6.0，最后定容在1000ml)5.PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5m

2、in(室溫或37度，避光)。肝組織過氧化物酶含量高。需增加濃度或增長(zhǎng)時(shí)間。蒸餾水洗2minx3次8.pbs曲拉通通透（pv法不需要）9.與二抗種屬一致的血清封閉非特異位點(diǎn)。（pv法不需要）9.滴加一抗4℃過夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室溫或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB顯色5~20min，自來水充分涮洗16.蘇木素復(fù)染2~3min，自來水充分涮洗17.氨水反藍(lán)，過藍(lán)可用鹽酸酒精分化2s，自

3、來水充分涮洗.用稀氨水返藍(lán)，自來水里加幾滴稀氨水，就行了，返藍(lán)時(shí)間5分鐘左右，就很好看了淡氨水有人用50ml自來水＋三四滴的氫氧化銨；18.脫水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性樹脂，加蓋玻片(組織部位切勿殘留小氣泡)，自然晾干二、操作流程1、脫蠟和水化脫蠟前，應(yīng)將組織芯片放在60℃恒溫箱中烘烤2h以上，

4、然后按以下流程進(jìn)行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸餾水（15min）2、3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。3、甩去H2O2，蒸餾水洗2min3次。4、抗原熱修復(fù)：將切片置于裝有抗原修復(fù)液的玻璃容器中（耐高溫），進(jìn)入微波爐內(nèi)，容器內(nèi)液體溫度達(dá)到95～100℃后斷電，連續(xù)三次。5、PBS沖洗5

5、min3次。6、5%BSA封閉液20min，甩去。7、用0.1molLPBS稀釋一抗100倍，滴加后4℃過夜。8、PBS沖洗2min3次，滴加二抗37℃20min，PBS沖洗2min3次，滴加SABC37℃20min，PBS沖洗5min4次，顯色劑顯色。出來后就感覺本人已經(jīng)把握了免疫組化方法，調(diào)換一種抗體后，竟然連二抗的種屬來源都拿錯(cuò)了。失利常常促進(jìn)你去思測(cè)驗(yàn)驗(yàn)原理和過程，樂成有時(shí)也加速你自負(fù)。1、觀點(diǎn)戰(zhàn)經(jīng)常使用辦法先容1、界說用標(biāo)記的

6、特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的漫衍和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)技術(shù)。2、原理按照抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色道理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗本來和一抗結(jié)合，再操縱一抗與標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用符號(hào)辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如

7、鏈霉親和素等)結(jié)合，最后通過呈色反應(yīng)或熒光來顯現(xiàn)細(xì)胞或組織中化學(xué)身分，在光學(xué)顯微鏡或熒鮮明微鏡下可清楚瞥見細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)品，從而可以在細(xì)胞爬片或組織切片上原位肯定某些化學(xué)成分的散布和含量。3、分類1)按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。2)按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)

8、。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3)按結(jié)合方式可分為抗原抗體結(jié)合，如過氧化物酶抗過氧化物酶(PAP)法；親和毗連，如蛋白素生物素過氧化物酶復(fù)合物(ABC)法、鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶保持(SP)法等，個(gè)中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測(cè)。4、現(xiàn)在幾種常用免疫組化方法簡(jiǎn)樸引見1)免疫熒光方法是最早成立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它哄騙抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已