免疫組化方法和步驟

1、威斯騰生物4006756758免疫組化檢測免疫組化檢測CD34的表達(dá)的表達(dá)1基本原理基本原理免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。威斯騰生

2、物威斯騰生物40067567584006756758（1）1PBS（pH7.4，2.5L=20.0157g137mMNaCl0.499552g2.68mMKCl0.50013075g1.47mMKH2PO47.253337g8.1mMNa2HPO4），115℃15min；（2）0.85%NaCl500ml=4.25gNacl500ml三蒸水，115℃15min；（3）4%多聚甲醛500ml=20g多聚甲醛500mlPBS在65℃水箱中3

3、h多，再放入4℃保存。（4）DNaseIbuffer：40mMTrisHCl（pH7.9）10mMNaCl6mMMgCl210mMCaCl2；（5）ProteinaseKbuffer：100mMTrisHCl（pH8.0）50mMEDTA；（6）DNase1（原液1000Uml按1：99DNase1緩沖液稀釋至10Uml）；（7）DAB工作液（臨用前配制，5ul20DAB1ul30%H2O294ulPBS）（8）20μgmlProtei

4、naseK工作液（按1：500稀釋貯存液1mgml）。威斯騰生物4006756758然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時(shí)，裝盒備用。3.PolyLLysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時(shí)或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。3.2常用酶消化：1）胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時(shí)間為37℃、10~40

5、分鐘，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。2）胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時(shí)間為37℃、30~180分鐘，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），CollagenIV（IV型膠原）等。3）皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10gml的saponin溶液，消化時(shí)間為室溫孵育30分鐘。3.3抗原熱修復(fù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)?？乖瓱嵝迯?fù)可選用各種緩沖液，如TBS

6、、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。3.3.1石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對溫度和時(shí)間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~

7、20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。3.3.2石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)（約加熱5~6分鐘后），計(jì)時(shí)1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，

8、蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘3，下接免疫組化染色步驟。3.3.3石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計(jì)時(shí)15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。3.3免疫組化染色步驟：1、石蠟切片脫蠟，100%二甲苯10minX250%二甲苯5m