免疫組化技術常見問題及處理方法

1、免疫組化技術常見問題及處理方法,,免疫組織化學的定義,用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術,免疫組織化學的原理,根據(jù)抗原抗體反應和化學顯色原理組織切片或細胞標本中的抗原和一抗結(jié)合利用一抗與標記生物素（HRP、 AKP ） 、熒光素等的二抗進行反應通過呈色反應或熒光顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡觀

2、察確定某些化學成分的分布和含量,,免疫組織化學的分類,按標記物質(zhì)的種類，可分為酶標記、膠體金標記、熒光標記和放射性標記等按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多,,按結(jié)合方式可分為抗原- 抗體結(jié)合，如過氧化物酶- 抗過氧化物酶（PAP ）法；親和連接，如卵白素- 生物素-過氧化物酶復合物（ABC ）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法等SP法是比較常用

3、的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測,可被檢測的物質(zhì),組織或細胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測,免疫組織化學的特點,1）特異性強2）敏感性高3）定位準確、形態(tài)與功能相結(jié)合,Western blotting、ELISA與免疫組化的異同,Western blotting：蛋白質(zhì)免疫印跡，檢查組織或

4、細胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測方法，與免疫組化技術相比，定量可能更加準確；也可定性和定位，但敏感性遠遠低于免疫組化技術ELISA ：酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測，與免疫組化技術相比，定量最準確，是分泌性蛋白檢測首選方法之一,免疫組織化學方法的基本步驟,組織和細胞的處理抗原修復染色,鼠單克隆抗體或多克隆抗體（兔抗血清）,鼠單克隆抗體特異性較高背景較干凈有多種潛在用途但敏感性、親和力低,兔多克隆抗體（兔抗血

5、清）高敏感性、親和力可能有較多的交叉反應更多的潛在用途,SP法,1. 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3分鐘。 2. 根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復。 3. 每張切片加1滴或50μl過氧化酶阻斷溶液(試劑A)，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。 4. 除去PBS液，每張切片加1滴或50μl正常非免疫動物血清(試劑B)，室溫下孵育10分鐘。

6、5. 除去血清，每張切片加1滴或50μl的第一抗體(用戶自選)，室溫下孵育60分鐘或4℃過夜，建議參見每種抗體的說明書。 4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min， PBS沖洗3次，每次3分鐘。,,6. 除去PBS液，每張切片加1滴或50μl生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10分鐘。PBS沖洗3次，每次3分鐘。 7. 除去PBS液，每張切片加1滴或50μl鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10分鐘

7、。PBS沖洗3次，每次3分鐘。 8. 除去PBS液，每張切片加2滴或100μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘。 9. 自來水沖洗，蘇木素復染，PBS或自來水沖洗返藍。 10.如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。,二步法(Envision系統(tǒng)),1）脫蠟、水化組織切片。 2）根據(jù)所應用的一抗的特殊要求，對

8、組織切片進行預處理。 3）0.3%或3%H2O2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 或TBS 沖洗。 4）滴加一抗，室溫或 37℃孵育30-60分鐘，或 4℃過夜，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。 5）滴加enhangcer 增強劑（試劑A），37度30min ，PBS或TBS浸洗3 分鐘×5次。 6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體（試劑B），室溫37℃孵育30

9、分鐘-1h，PBS/TBS沖洗3分鐘×5次。 7）應用DAB 溶液顯色。 8）蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。,Envision系統(tǒng)的優(yōu)點,敏感性高 背景干凈（消除內(nèi)源性生物素的干擾） 步驟簡單,石蠟切片標本的固定,1、組織離體后盡快固定，切開固定效果好2、固定液以10％中性福爾馬林緩沖液為佳3、固定時間在4h-24h之間，長時間固定會影響抗原決定簇的暴露，產(chǎn)生陰性結(jié)果4、固定液的量要超過組織體積5

10、倍以上 如果組織固定不及時或不完全固定,HE染色細胞核發(fā)灰模糊，對比不鮮明；免疫組化染色結(jié)果不理想，通常組織離體2h后抗原完全丟失,固定不充分,,,,,,,,,,,,,,,,標本的取材、脫水、浸蠟,標本的取材厚度以2mm為宜梯度酒精脫水盡量徹底充分二甲苯透明時間不宜長，1～3h為佳，透明過度會導致組織發(fā)硬發(fā)脆浸蠟應選擇低熔點的石蠟，浸蠟應充分 如果組織脫水、浸蠟不充分，蠟塊會出現(xiàn)組織收縮凹陷，而且在免疫組化熱抗原修復操

11、作時會容易脫片,標本的切片、撈片、烤片,切片通常以3～4um的厚度為宜,太厚易掉片，細胞重疊，對細胞膜陽性結(jié)果觀察不理想撈片要求達到無皺折、無氣泡，水溫宜在（48～50℃）80℃烘烤1～2h玻片用防脫片或多聚賴氨酸處理，以增強粘附性,冰凍切片的處理,冰凍切片的組織抗原保存好通常以5um的厚度為佳冷風吹干后用純丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱短期保存，－20℃冰箱長期干燥保存缺點是不易做出好的冰凍切片，易出現(xiàn)冰晶、細胞腫脹等

12、現(xiàn)象,細胞涂片的處理,培養(yǎng)細胞或細胞涂片，應自然晾干后用純丙酮固定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存,抗原修復,概念:應用物理或化學的方法將組織固定過程中封閉的抗原決定簇修復暴露的過程稱為抗原修復原因：甲醛固定過程中形成醛鍵和羧甲基而封閉部分抗原決定簇，固定時，蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián),可能會封閉抗原決定簇,抗原修復的方法,酶消化： 如胰蛋白酶、蛋白水解酶熱抗原修復（HIER）：水??；微波爐；高壓鍋；高壓消毒鍋；蒸汽室超聲波以上

13、綜合運用修復方法從強到弱為：高壓修復、微波修復、胰酶修復,熱抗原修復,更有效：染色結(jié)果更一致，操作更單一事先確定的熱修復時間可適用于幾乎所有的組織 一抗可以進一步稀釋（節(jié)省費用）有些抗體只有采用熱抗原修復才有效,高壓鍋熱抗原修復,比微波更有效能處理大批量的切片達到更高的溫度 加熱均勻（不像微波爐有熱點和冷點）和節(jié)省時間,高壓鍋熱抗原修復,將高壓鍋中的緩沖液煮開（不加蓋）將切片放入沸騰的緩沖液蓋緊蓋子和高壓閥，加熱至全

14、壓力達到全壓力后才能計時，最佳時間由各個實驗室自行確定----通常在2-4分鐘,熱抗原修復：注意事項,無論哪一步都不要讓切片干涸（抗原可完全丟失）加熱后需要冷卻15～30分鐘（個別未折疊的蛋白鏈恢復到原來的構(gòu)型）,熱抗原修復存在的問題,過度的熱修復會導致組織形態(tài)的破壞或組織完全消化，免疫染色變?nèi)趸蚨ㄎ徊粶蚀_有一個時間點，超過這個時間點進一步熱修復也不會獲得更強的染色效果解決方法：采用較短時間熱修復或酶消化重復實驗,修復過度的實

15、驗組,,修復過度的實驗組,,修復過度的對照組,,修復過度的對照組,,酶消化修復,,縮短修復時間,,熱修復抗原會導致內(nèi)源性生物素反應增強，應用卵白素抗生物素系統(tǒng)會產(chǎn)生假陽性　　富含內(nèi)源性生物素的組織：　　 — 肝細胞　 — 線抗體豐富的組織如腎臟、甲狀腺、嗜酸細胞等　　 — 胞漿豐富的腫瘤細胞,熱抗原修復的問題：內(nèi)源性生物素,組織在熱修復之后，用3％的新鮮H2O2進行封閉， 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10min

16、，再用10％雞（鴨）蛋清阻斷10～15分鐘，清洗后滴加一抗 應用非生物素系統(tǒng)的檢測試劑盒，如EnVision系統(tǒng),阻斷內(nèi)源性生物素的方法,熱抗原修復的緩沖液,pH6.0 檸檬酸緩沖液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品化修復液等堿性 pH 修復液常對絕大多數(shù)抗體的效果更好推薦使用：EDTA緩沖液 pH 8.0或Tris-EDTA緩沖液pH 9.0 是較好的常規(guī)修復液，可用于大多數(shù)熱修復有效的抗體,抗體孵育條件,主要抗體

17、濃度、溫度、時間，三者一般是相互成反比的（相對）濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應的速度，時間決定反應的量溫度有 4 度、室溫、37度，其中4 度最佳，反應最溫和，背景較淺；而 37度反應速度較快，時間較短；室溫不太提倡4度過夜和從冰箱拿出后需37度復溫45min,復溫的必要性,防止切片從4度直接放入PBS易脫片使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定 4度和37度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結(jié)合更快,但

18、敏感性也提高了并易造成非特異染色,脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片,多聚賴氨酸玻片的質(zhì)量問題切片問題：切片較厚或者不均勻組織本身的問題：癌癥組織中壞死組織越多越容易脫片烤片的時間短、溫度不夠操作的時候甩的過猛，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用吸水紙從邊緣上慢慢吸水修復的問題：抗原修復的時候高壓時間過長，玻片架放進沸騰的修復液時需輕柔,背景染色較深的原因,（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗

19、體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，避免因遺忘而造成時間延長。時間和溫度要根據(jù)染色結(jié)果進行調(diào)整,,（3）DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的DAB不應存放時間太長，DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終止反應（4）組織變干（5）切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太

20、長（大于24小時）（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體,DAB染色后切片著色呈陰性結(jié)果,抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤抗原修復不全或者不充分組織切片本身這種抗原含量低 血清封閉時間過長DAB孵育時間過短細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應,DAB顯色時間的把握,（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗（2）顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，說明抗體

21、濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短抗體孵育時間；或前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間 （3）顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，說明抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；或封閉時間過長,免疫組化對照和質(zhì)量控制,陽性對照陰性對照免疫組化的標準化外部質(zhì)量控制體系,,,,,,,,,,,脫水、透明、封片、拍照,脫水、透明要徹底封片時盡量避免留有氣泡拍照盡量在兩周內(nèi)拍照盡量選擇干凈、清

22、晰的視野，無雜質(zhì)無破碎組織所拍照片盡量在同一種狀態(tài)下，使背景保持一致照片標識清楚,免疫組化染色的評分,強度： 0分 無色 1分 淡黃色 2分 棕黃色 3分 棕褐色,細胞數(shù): 0分 無 1分 ≤10％ 2分 11－50％ 3分 51－75％ 4分 >75％,兩者乘積>3分為陽性。,乘積法：,免疫組