淇河鯽肌間骨及其形成相關(guān)基因SOST的研究.pdf

1、肌間骨是位于椎骨兩側(cè)肌間隔中的膜性硬骨小刺，由肌隔結(jié)締組織中的間充質(zhì)細(xì)胞不經(jīng)過軟骨階段而直接骨化成的膜性硬骨。肌間骨僅存在于低等真骨魚類中。這種骨化方式稱為膜內(nèi)骨化或結(jié)締組織性骨化，又稱纖維性骨化或膜性硬骨骨化，是成骨細(xì)胞在骨質(zhì)中發(fā)生鈣質(zhì)沉著從而生成骨組織的兩種方式中的一種。魚類肌間骨分為脈弓小骨、髓弓小骨和椎體小骨3類。本研究對(duì)低等真骨魚類肌間骨發(fā)生的可能生理機(jī)制進(jìn)行了文獻(xiàn)分析;對(duì)淇河鯽肌間骨的發(fā)生和形態(tài)數(shù)量進(jìn)行了觀察分析;對(duì)肌間骨發(fā)

2、生相關(guān)蛋白——硬化蛋白基因SOS進(jìn)行了克隆和組織差異性表達(dá)分析。結(jié)果表明:
　　1.真骨魚中，魚體肌肉中的筋膜以膜內(nèi)骨化的形式骨化。一些或所有的這些筋膜可以沿身體相應(yīng)部位骨化，最終形成肌間骨。骨化筋膜數(shù)量的變異部分受遺傳因素控制，如鲆科(Bothidae)魚類和鯉魚（Cyprinus carpio L）。斑馬魚(Danio rerio)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)和唇(鰓)(Hemibarbus

3、labeo)的肌間骨都是在其他骨骼骨化結(jié)束后才開始骨化。肌間骨的形成過程與其他以膜內(nèi)骨化形式成骨的骨骼的形成過程很可能存在分子調(diào)控上的差異。肌間骨的形成過程經(jīng)歷了肌膈結(jié)締組織的生成和骨化，以及后續(xù)的礦化、生長和形態(tài)演化。
　　肌隔結(jié)締組織膜產(chǎn)生后，血管附著增生，以供應(yīng)骨形成所需的營養(yǎng)和氧。間充質(zhì)細(xì)胞分裂分化出骨原細(xì)胞。部分骨原細(xì)胞增大分化成成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞分泌類骨質(zhì)包埋自身，成為骨細(xì)胞;這些類骨質(zhì)礦化成骨基質(zhì)，形成骨化中心（又稱

4、骨化點(diǎn)）。新生骨組織的表面附著有骨原細(xì)胞或成骨細(xì)胞，進(jìn)一步向周圍成骨和不斷骨化長長。同時(shí)，完成從點(diǎn)到線，再到“y”或“卜”等形狀的變化。魚類肌間骨形成的分子機(jī)制主要集中在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的定向分化及后者的成熟、增殖、分泌類骨質(zhì)和類骨質(zhì)礦化成骨質(zhì)方面。在體內(nèi)環(huán)境中，成骨細(xì)胞與骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等有著廣泛的聯(lián)系，同時(shí)受自分泌或旁分泌的局部調(diào)節(jié)因子和激素等系統(tǒng)性調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)。鰱魚和斑馬魚肌間骨骨化時(shí)機(jī)與其在魚體頭尾方向上的分布顯然有

5、相關(guān)關(guān)系，這很可能是激素等系統(tǒng)性調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)所致。成骨細(xì)胞定向分化受到核心結(jié)合因子A1、矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、Sp7轉(zhuǎn)錄因子、豪豬蛋白等因子的調(diào)控。
　　2.通過對(duì)淇河鯽仔魚、稚魚的整體骨骼染色和對(duì)淇河鯽成魚的解剖，觀察淇河鯽肌間骨的發(fā)生變化和成熟形態(tài)數(shù)量等特征。結(jié)果顯示:淇河鯽全身只有髓弓小骨和脈弓小骨，共約83至86根，無椎體小骨。25dpf，髓弓小骨首先出現(xiàn)，分布在背部第20至第22肌膈中，長全后均勻分布于魚體背部肌膈中;脈

6、弓小骨只分布在泄殖孔附近及往后的腹部肌膈中。45dpf，淇河鯽全身肌間骨全出現(xiàn)。淇河鯽肌間骨形態(tài)簡單，除尾柄處的8根較粗壯外，其余均呈“I”形或“y”形。
　　3.以淇河鯽背部肌肉總RNA為模板，用斑馬魚SOST的mRNA的保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行同源克隆，用克隆得到的473 bp序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)3'和5'序列進(jìn)行RACE擴(kuò)增，并克隆測序。淇河鯽硬化蛋白基因全長2190 bp，編碼211個(gè)氨基酸。序列比對(duì)顯示，硬化蛋白的碳端胱氨酸結(jié)樣

7、域在脊椎動(dòng)物中高度保守。據(jù)此構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，硬骨魚類間親緣關(guān)系較近。對(duì)淇河鯽8種組織或器官中SOST的實(shí)時(shí)定量PCR研究表明，各組織中均有SOST表達(dá)，表達(dá)水平高低依次為:腦、肝臟、鰓、脾臟、腎臟、腸。SOST在心臟和長有肌間骨的背部肌肉中的表達(dá)量幾乎檢測不到。這些結(jié)果提示SOST可能參與淇河鯽肌間骨骨化形成的負(fù)調(diào)控。
　　本研究表明，淇河鯽肌間骨數(shù)量多，形成機(jī)制復(fù)雜;高等動(dòng)物體內(nèi)的膜內(nèi)骨化機(jī)制可供參考，但可供查閱參考的綜合