鹽酸克倫特羅ELISA檢測(cè)方法的建立及其納米抗體的篩選.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷提高，食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注。一定劑量的鹽酸克倫特羅喂養(yǎng)動(dòng)物以后能夠明顯增加動(dòng)物的瘦肉率，因此受到不良商家的追捧。人在食用了含有鹽酸克倫特羅的肉及肉制品后會(huì)出現(xiàn)不同程度的中毒情況，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)(ELISA)在檢測(cè)鹽酸克倫特羅殘留方面具有可定量、靈敏度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)?？贵w制備是ELISA檢測(cè)方法建立中的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的多克隆抗體制備雖然簡(jiǎn)單，但抗體純度不夠高，特異性差，易發(fā)生交叉反

2、應(yīng)。而單克隆抗體生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、技術(shù)難度高，需要真核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。納米抗體是來(lái)源于駱駝科動(dòng)物體內(nèi)重鏈抗體的最小的完整功能性抗原結(jié)合片段，分子質(zhì)量?jī)H為15KDa，具有親和力高、穩(wěn)定性好、篩選周期短、易于耦合成多價(jià)抗體等優(yōu)點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)首先采用重氮法合成了OVA與CL偶聯(lián)比為1：28.7的完全抗原。通過(guò)rProteinA對(duì)兔抗鹽酸克倫特羅的多克隆抗體進(jìn)行了純化，純化后的抗體效價(jià)為1:80000，濃度為0.667mg

3、/mL，用于鹽酸克倫特羅ELISA檢測(cè)方法的建立其特異性有所提高。采用合成的完全抗原和親和純化后的抗體建立CL的ELISA檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)合成抗原包被濃度、一抗工作濃度、封閉液工作濃度等條件的優(yōu)化，最終檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到6.4ng/mL。
　　最后利用噬菌體展示技術(shù)，從天然的納米抗體噬菌體文庫(kù)中篩選鹽酸克倫特羅的納米抗體，經(jīng)過(guò)三輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”、ELISA陽(yáng)性鑒定后，從96個(gè)單菌落中挑選出了3株陽(yáng)性克隆。本課題最終有望為EL