鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備及其CiELISA檢測方法的建立.pdf

1、鹽酸克倫特羅(Clenbuterol，CL)，是一種人工合成的β2-腎上腺素受體激動劑，與萊克多巴胺、沙丁胺醇等藥物統(tǒng)稱為“瘦肉精”。最初作為臨床上支氣管擴(kuò)張劑使用，防治支氣管哮喘、慢性支氣管炎等疾病，但由于其副作用較大而停止使用。CL具有改變?nèi)庑篌w內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)重新分配的功能，減少脂肪的合成與積累，加快蛋白質(zhì)的合成速度，從而改變畜肉品質(zhì)。然而，肉畜食用高劑量的CL后會產(chǎn)生大量的殘留，食用殘留有CL的動物源性食品會對人體產(chǎn)生毒副作用，影響人

2、體健康。因此，世界各國明令禁止將CL作為飼料添加劑使用，我國農(nóng)業(yè)部也嚴(yán)令禁止使用。然而國內(nèi)仍有非法者將之大量用于肉畜生產(chǎn)以牟取暴利。
　　 目前國內(nèi)外已建立多種方法檢測CL的殘留，包括儀器分析法，如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS);免疫學(xué)分析方法，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠體金免疫測定法(CGIA)等。雖然色譜技術(shù)能準(zhǔn)確、高效的檢測CL的殘留，但存在方法復(fù)雜、耗時長、技

3、術(shù)要求高等問題且需要昂貴的儀器、專業(yè)的操作技能，不適合大批量樣品的篩選。而ELISA方法可以解決這些問題，它是一種簡單、準(zhǔn)確、高效、廉價、特異的檢測方法，適于大批量樣品的快速篩選。
　　 本研究以單克隆抗體和酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)為基礎(chǔ)，通過蛋白質(zhì)連接技術(shù)合成CL人工抗原，研制出針對CL的單克隆抗體，建立檢測CL殘留的CiELISA檢測方法。
　　 1.CL人工抗原的合成與鑒定。通過重氮法將CL與載體蛋白(BSA、OVA)

4、偶聯(lián)，合成人工抗原CL-BSA、CL-OVA，通過紫外掃描和免疫學(xué)方法初步鑒定偶聯(lián)成功。兩種抗原CL-BSA、CL-OVA的結(jié)合比例分別為12:1和10:1。
　　 2.CL單抗的制備。通過對比實(shí)驗(yàn)，將CL-BSA作為免疫原，CL-OVA作為包被原。用CL-BSA常規(guī)免疫BALB/c小鼠，五免后血清效價達(dá)1:16000以上。通過雜交瘤技術(shù)和酶聯(lián)免疫技術(shù)最后篩選獲得3株能穩(wěn)定分泌抗CL特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其中一株細(xì)胞8D

5、2分泌的抗體對CL的表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力，制備的腹水效價為1:120000，蛋白濃度為21.8mg/mL。
　　 3.ELISA檢測方法的建立。利用8D2雜交瘤細(xì)胞制備的抗CL腹水建立檢測CL殘留的間接競爭ELISA方法。采用包被原最佳稀釋濃度1:10000，腹水抗體的工作濃度1:60000，藥物濃度在0.5～50ng/mL范圍內(nèi)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為:y=-0.5015x+0.7438，相關(guān)系數(shù)R2=0.9919，IC50為2

6、.15ng/mL，檢測限低于0.5ng/mL，定量限為0.97ng/mL。交叉實(shí)驗(yàn)表明，該單抗對CL表現(xiàn)出高度的特異性，與其他一些β-腎上腺素激動劑藥物無交叉反應(yīng)。
　　 4.添加回收實(shí)驗(yàn)。將建立的檢測CL的ELISA方法應(yīng)用于豬肝臟組織的添加回收實(shí)驗(yàn)，樣品經(jīng)前處理后用于測定。當(dāng)樣品處理液作4倍以上稀釋時，樣品基質(zhì)干擾基本消失。在0～50ng/mL范圍內(nèi)，曲線標(biāo)準(zhǔn)方程:y=-0.4114x+0.7063，R2=0.9886，IC