氯霉素及鹽酸克倫特羅殘留ELISA檢測(cè)方法研究.pdf

1、氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一種廣譜高效的抗菌劑，它可以和大多數(shù)藥物和飼料添加劑混用，在喂養(yǎng)過(guò)程中穩(wěn)定，藥效不會(huì)降低。由于該類(lèi)藥物的廣泛使用，使其在動(dòng)物源性食品上的檢出率越來(lái)越高，氯霉素在食品中殘留會(huì)引起嚴(yán)重的后果，如可能抑制人體骨髓造血功能從而引起再生性障礙性貧血癥等。 而鹽酸克倫特羅(clenbuterol hydrochloride，CL)是一種B2一腎上腺素受體激動(dòng)劑。最初在臨床上主要用于防治人、畜

2、支氣管哮喘和痙攣。因其具有改變動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝，降低胴體脂肪，提高瘦肉率，同時(shí)使動(dòng)物增重，提高飼料使用率的作用被不法商人用于做飼料添加劑。然而β-激動(dòng)劑在動(dòng)物體內(nèi)的蓄積性殘留會(huì)對(duì)食用者的食用安全構(gòu)成潛在威脅：人類(lèi)食用超過(guò)鹽酸克倫特羅殘留限量的肉后會(huì)出現(xiàn)心悸、肌肉震顫、嘔心嘔吐、發(fā)熱寒戰(zhàn)等臨床癥狀，特別對(duì)心臟病、糖尿病、高血壓等病人危害更大。 因此，研究用于氯霉素和鹽酸克倫特羅的ELISA檢測(cè)試劑盒，對(duì)于保護(hù)消費(fèi)者利益，對(duì)于食品安全

3、檢測(cè)以及國(guó)際貿(mào)易有重要的意義。本研究對(duì)鹽酸克倫特羅和氯霉素的人工抗原的合成以及ELISA檢測(cè)方法的建立等進(jìn)行了研究，得出如下研究結(jié)果： 鹽酸克倫特羅和氯霉素分別與載體蛋白-牛血清白蛋白(BSA)通過(guò)重氮法合成了免疫抗原，經(jīng)紫外、蛋白電泳實(shí)驗(yàn)證明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功，同時(shí)使用相同方法與載體蛋白卵白蛋白(OVA)合成了包被抗原。 合作單位用合成的免疫抗原制備了氯霉素鼠單抗，鹽酸克倫特羅兔多抗，用合作單位制備的氯霉素鼠單抗

4、，鹽酸克倫特羅兔多抗對(duì)氯霉素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，得到上述ELISA檢測(cè)方法的靈敏度、線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性擬合并對(duì)檢測(cè)步驟、檢測(cè)時(shí)間等因素進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示較合適的檢測(cè)條件為：鼠單抗使用濃度為稀釋1600倍，包被抗原稀釋100倍并且4℃包被12小時(shí)可獲得較好的試驗(yàn)結(jié)果。其他條件通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終選擇最佳包被時(shí)間為4℃12h，一抗最佳作用時(shí)間為60min，二抗最佳作用時(shí)間為60min，底物作用時(shí)間為15min。對(duì)底物配方進(jìn)行優(yōu)

5、化，得到TMB和H202的最佳組合為450μLTMB(10mgTMB溶于2mLDMSO)+5μL的H2O2。用優(yōu)化后的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法測(cè)得氯霉素最低檢測(cè)限0.3837ng/mL，接近到歐盟法規(guī)(EC-decisions 2003/181/EC and 2004/25/EC)規(guī)定的0.3ng/mL。 同時(shí)，鹽酸克倫特羅也采用間接ELISA方法其兔多抗?jié)舛葹橄♂?000倍，包被抗原稀釋100倍后，包被時(shí)間為4℃12h。其他