丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E1的純化及性質(zhì)研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)經(jīng)血液傳播引起的慢性傳染性疾病在全球流行，它是引發(fā)全球慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因。到目前為止并沒(méi)有有效的預(yù)防保護(hù)性疫苗，治療手段容然受限制。而現(xiàn)在常用的聚乙二醇干擾素-α和利巴韋林結(jié)合的治療手段，也只是對(duì)50％的病人有效力，最終患者長(zhǎng)期伴隨有慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的后遺癥。包膜糖蛋白E1作為HCV的結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有重要的受體結(jié)合位點(diǎn)、抗原表位作用，在病毒生命周期和宿主免

2、疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此包膜蛋白普遍被認(rèn)為是疫苗研究的靶標(biāo)。
　　 本課題通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)HCV E1基因進(jìn)行全面了解，利用分子克隆手段將HCV的結(jié)構(gòu)蛋白E1基因分別構(gòu)建到原核和真核表達(dá)載體上，并分別在其中表達(dá)。通過(guò)結(jié)果比較顯示，E1在原核中單獨(dú)表達(dá)(重組質(zhì)粒DET-28a-E1)時(shí)檢測(cè)不到目的條帶，但通過(guò)與多角體融合后(重組質(zhì)粒pET-28a-polh-E1)可以大量表達(dá)，為包涵體形式，在50 kD左右有明顯的條帶。利用

3、多角體的溶解性質(zhì)采用調(diào)節(jié)pH以及Ni柱親和層析純化的方法，都可以純化得到目的蛋白。
　　 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為一種常用的真核表達(dá)系統(tǒng)，不僅能夠大量表達(dá)外源蛋白，而且具有轉(zhuǎn)錄后加工的能力，表達(dá)的蛋白為可溶性蛋白，能夠保持天然的活性。E1基因通過(guò)Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)在家蠶BmN細(xì)胞和五齡幼蟲中表達(dá)時(shí)，都能得到不同程度糖基化的部分可溶性蛋白，分子量為26～35 kD。通過(guò)抗體親和層析或凝膠過(guò)濾層析、ELISA與抗體親和層析等相

4、結(jié)合的方法能夠較好的從細(xì)胞和蠶血淋巴中純化得到E1蛋白。這將解決HCV疫苗研究中無(wú)法獲得大量天然的病毒蛋白的難題，為HCV疫苗的進(jìn)一步研究提供重要的參考和依據(jù)。
　　 通過(guò)糖苷酶酶切對(duì)純化得到的E1蛋白進(jìn)行去糖基化分析，能夠得到分子量為21～26 kD之間的蛋白，較酶切前分子量減小5～10 kD。這些不同大小分子量的蛋白說(shuō)明E1在真核表達(dá)系統(tǒng)中得到了不同的糖基化修飾。通過(guò)進(jìn)一步深入研究HCV E1的性質(zhì)及特點(diǎn)，將有助于HCV疫苗