丙型肝炎病毒高變區(qū)1對HCV E2蛋白免疫原性抑制作用研究.pdf

1、一、丙型肝炎病毒高變區(qū)1對HCV E2蛋白免疫原性抑制作用研究
　　 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科。HCV基因組長約9.6 kb，整個基因組只有一個開放閱讀框架，編碼的多聚蛋白前體在病毒和宿主蛋白酶的作用下形成結(jié)構蛋白(核心蛋白C以及糖基化的包膜蛋白E1、E2)和非結(jié)構蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。目前全世界HCV感染

2、者約1.7億，感染導致的慢性肝病是一個嚴重的全球性的公共衛(wèi)生難題。HCV感染的標準療法是聚乙二醇化的IFN-α與利巴韋林的聯(lián)合應用，2、3型HCV感染對該療法的反應率達到75％，但最流行的1型HCV感染的持續(xù)反應率不到50％。自HCV基因克隆以來，開發(fā)HCV疫苗一直是研究熱點，但迄今為止，尚無任何有效的疫苗問世。
　　 研究表明，HCV包膜糖蛋白能夠誘使機體產(chǎn)生中和抗體，阻斷病毒的入侵。包膜E2蛋白是誘導中和抗體的主要靶抗原，雖

3、然E2蛋白的變異性較高，但近年來在E2中鑒定出了一系列保守的中和抗體表位。高變區(qū)1(hypervariable region1，HVR1)是位于E2蛋白氨基末端的由27個氨基酸殘基組成的肽段，因序列高度變異而被命名。HVR1是HCV感染所必需的肽段，也是重要的中和抗體靶向位點。HVR1被認為是導致HCV免疫逃避而形成慢性感染的獨立影響因素。在HCV感染早期，針對HCV包膜蛋白的抗體主要為HVR1抗體，針對保守表位的交叉中和抗體往往在慢性

4、感染階段才能檢測到。本研究中，我們分別構建了分泌型E2蛋白和刪除HVR1的分泌型E2蛋白的表達質(zhì)粒，通過小鼠免疫，比較二者免疫原性的差異，探討HVR1對HCV包膜蛋白免疫原性的影響。
　　 方法：
　　 1.構建分泌型E2蛋白和刪除HVR1的分泌型E2蛋白表達質(zhì)粒pCI-1a661、pCI1a661△。
　　 2.將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，用Western、ELISA及免疫熒光檢測E2蛋白的表達。
　　

5、 3.用流式細胞術檢測HVR1對E2蛋白與SR-B1和CD81結(jié)合活性的影響。
　　 4.將質(zhì)粒免疫小鼠。
　　 5.分別用ELISA和免疫熒光檢測小鼠免疫血清中的E2抗體與HVR1抗體。
　　 6.免疫熒光檢測小鼠血清對多種HCV基因型E2蛋白的交叉反應性。
　　 7.制備多種基因型的HCVpp，檢測小鼠血清的中和活性。
　　 結(jié)果與討論：
　　 1.轉(zhuǎn)染的293T細胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中均

6、能檢測到E2蛋白，刪除HVR1對E2蛋白的表達、分泌以及構象無明顯影響；
　　 2.缺失HVR1使E2蛋白的SR-BI結(jié)合活性完全喪失，但增強E2蛋白與CD81的結(jié)合活性；
　　 3.pCI-1a661能誘導E2抗體，但其中針對HVR1的抗體占絕對優(yōu)勢；以1a661A作為抗原檢測小鼠血清，則pCIla661A誘導的抗體顯著強于pCI-1a661；
　　 4.用不同基因型E1E2作為檢測抗原，表明缺失HVRl能顯著

7、提高E2蛋白誘導交叉中和抗體；
　　 5.HCVpp中和試驗表明，pCI-1a661免疫血清的中和作用主要依賴于HVR1抗體，缺失HVR1能顯著提高E2誘導交叉中和抗體。這些結(jié)果表明：HVR1顯著抑制E2蛋白中其他抗體表位的免疫原性，這可能是急性HCV感染者體內(nèi)難以產(chǎn)生交叉保護性抗體的重要原因，缺失HVR1可顯著提高E2蛋白誘導交叉中和抗體，對于研發(fā)HCV疫苗有重要意義。
　　 二、一例HBsAg陰性/anti-HBs陽

8、性者全長S基因及HBV基因組的克隆和序列分析
　　 乙型肝炎病毒(HBV)是一種小的雙鏈DNA病毒，屬嗜肝DNA病毒科(Hepadnavividae)。乙肝病毒感染肝細胞后，能引起一系列的疾病，如急性肝炎、慢性肝炎，并是肝硬化及肝細胞癌的重要致病因子。全世界HBV感染者達3.5億之多，我國約一半以上人口感染過HBV，其中慢性感染者約有1.2億，是嚴重的公共衛(wèi)生問題。
　　 HBV DNA復制中存在逆轉(zhuǎn)錄過程，因而HBV的

9、變異率明顯高于其他DNA病毒。HBV表面抗原是介導HBV感染和誘導中和抗體的關鍵蛋白，表面抗原基因也是HBV基因組中的熱點變異基因，表面抗原基因變異與HBV的免疫逃避以及對核苷類藥物耐藥密切相關。我們對一例HBsAg陰性、抗-HBs陽性而HBV DNA陽性病例進行了S基因以及全基因組克隆，發(fā)現(xiàn)S基因中存在多種不同的變異，其意義值得深入研究。
　　 方法：
　　 1.用PCR法擴增和克隆全長S基因(包括PreS及HBsAg

10、基因)；
　　 2.用PCR擴增和克隆HBV全基因組；
　　 3.對獲得的全長S基因不同克隆進行測序和比對。
　　 結(jié)果與討論：
　　 1.獲得了17個全長S基因克隆和11個HBsAg基因克?。?br>　　 2.比對結(jié)果顯示，全長S基因存在復雜變異：preS1第58至118位共61位氨基酸缺失突變(這種缺失突變國內(nèi)外均有報道)，并且，變異株的HBsAg基因中均存在至少一個內(nèi)部的終止密碼子，部分變異株在p

11、reS1基因的N末端還存在一個終止密碼子，這類變異株為優(yōu)勢毒株(11/17)；部分克隆的HBsAg在第115和116位氨基酸之間插入了NTTT四個氨基酸殘基。由于復雜突變的變異株不能產(chǎn)生功能性包膜蛋白， S基因與HBV DNA聚合酶基因完全重疊，而這類變異株為優(yōu)勢毒株，其機制和意義值得深入研究。HBsAg中的NTTT插入突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)(我們在多例HBsAg和HBV DNA陽性的感染者血清中擴增出)，是否參與HBV的免疫逃避尚待進一步研究