產鄰苯二酚菌株的篩選及相關基因的克隆.pdf

1、本工作從土壤中篩選到一株能利用苯甲酸鈉產鄰苯二酚的假單胞菌株B3-1。通過對菌株B3-1在不同底物濃度、溫度和pH條件下產鄰苯二酚條件的優(yōu)化，鄰苯二酚產量最高能達到1.57mg/mL，其最適生長條件為32℃、pH 6.0～7.0，產鄰苯二酚的最佳底物濃度為3mg/mL。 以假單胞菌B3-1為出發(fā)菌株，進行了固定化細胞生產鄰苯二酚的初步研究。通過明膠、海藻酸鈉和聚乙烯醇三種固定化材料的比較，最終確定了使用海藻酸鈉作為固定化載體。通

2、過正交實驗，固定化的最佳條件為：菌體量0.3 g/mL；氯化鈣濃度為4％；海藻酸鈉濃度為3％；鈣化時間為4小時。 用柯斯質粒pWEB::TNC為載體構建了Pseudomonas sp．B3-1含約20000個克隆的基因組文庫，隨機挑取其中的14個克隆提取質粒進行BamHI酶切分析，結果顯示所有的質粒都含有插入片段，最大為52kb，最小為31kb，平均大小為41.5 kb，14個質粒的酶切帶型都不相同，說明文庫克隆的外源DNA片段

3、隨機性比較大。 通過活性篩選得到含編碼鄰苯二酚合成基因的陽性克隆45個。從陽性克隆Ben19中得到苯甲酸雙加氧酶基因benABCD， BlastX表明該序列與來自于Pseudomonas entomophila str.L48(GenBank索引號：CT573326)的苯甲酸雙加氧酶ben基因簇有91％的同源性。benA具有一個1329bp的ORF，可編碼含442個氨基酸的蛋白質，編碼產物與來自假單胞菌的苯甲酸鈉雙加氧酶BeIt

4、A(GenBank索引號AAX47023.1)具有96％一致性和99％相似性。benB具有一個486bp的ORF，編碼含161個氨基酸的蛋白質，編碼產物與來自Pseudomonas entomophila str.L48的苯甲酸鈉雙加氧酶BenB(GenBank索引號AAX47024.1)具有91％一致性和97％相似性。benC具有一個1011bp的ORF，編碼含336個氨基酸的蛋白質，編碼產物與來自假單胞菌的苯甲酸鈉雙加氧酶BenC(