丹參NOX基因鑒定及SmRbohE基因的克隆.pdf

1、NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)是植物產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的來源之一，NOX家族成員眾多，功能多樣，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中和生物和非生物脅迫應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶有著重要的作用，而且在藥用植物中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶與植物次生代謝有緊密聯(lián)系。本研究以丹參為實(shí)驗(yàn)材料，利用RACE擴(kuò)增技術(shù)，然后從丹參中克隆得到一條完整SmRbohE基因的cDNA序列，并對(duì)

2、其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中NOX基因家族的cDNA和其所翻譯表達(dá)的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析用水楊酸、茉莉酸甲酯、過氧化氫處理丹參懸浮細(xì)胞后其丹參NOX家族基因的相對(duì)表達(dá)量以及在不同組織部位的表達(dá)特異性。構(gòu)建了SmRbohE過表達(dá)載體和RNAi沉默（RNA interference，RNAi）載體，把表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并用農(nóng)桿菌侵染丹參無菌苗葉片得到轉(zhuǎn)基因丹參，從而研究在次生代謝中丹酚酸B

3、合成過程中SmRbohE的作用。實(shí)驗(yàn)取得了下列主要研究成果:
　　1.依據(jù)NOX蛋白特有功能域，在現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)基礎(chǔ)上對(duì)丹參NOX同源基因進(jìn)行檢索，鑒定到3個(gè)丹參NOX同源基因;采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)的方式，補(bǔ)充得到SmRbohE基因。綜上，共鑒定到3個(gè)丹參NOX同源基因。
　　2.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)丹參SmRbohA、SmRbohC、SmRbohE的蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)3個(gè)蛋白都有NADPH氧化酶結(jié)構(gòu)域，而且都有一個(gè)跨膜結(jié)

4、構(gòu)域因此都是跨膜蛋白，丹參SmRbohA蛋白有938個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為9.23，分子量為107303.32，平均疏水性-0.251。丹參SmRbohC蛋白有935個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為9.06，分子量為105232.13，平均疏水性-0.340。丹參SmRbohE蛋白有908個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.98，分子量為101983.07，平均疏水性-0.124，丹參SmRbohA、SmRbohC、SmRbohE均無信號(hào)肽，不是分泌蛋白。構(gòu)建丹參中N

5、OX家族基因系統(tǒng)發(fā)育樹，SmRbohA與SiRbohA相似度最高為90％，SmRbohA與AtRbohF相似度為78％，SmRbohE與SiRbohE相似度最高為85％，SmRbohE與AtRbohE相似度為64％。SmRbohC與SiRbohC相似度最高為90％，SmRbohC與AtRbohC相似度為68％。
　　3.克隆出SmRbohE的基因，得到了其cDNA全長(zhǎng)，命名為SmRbohE。SmRbohE全長(zhǎng)cDNA全長(zhǎng)為3020

6、bp，包含147bp的5'-URT，146bp的3'-URT和一個(gè)2727bp的開放閱讀框(ORF)。
　　4.利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)NOX基因家族在丹參植株根、莖、花、葉和愈傷組織中的表達(dá)量，SmRbohA在葉和愈傷組織中表達(dá)量最高，在花中也有很高的表達(dá)，SmRbohC在葉中表達(dá)量最高，SmRbohE在葉和愈傷組織中表達(dá)量最高。用不同激素、信號(hào)分子處理丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果表明，水楊酸、茉莉酸甲酯、過氧化氫均能使SmRboh