苔類植物多酚及萜類化合物生物合成途徑相關(guān)基因的克隆與功能研究.pdf

1、苔蘚植物在植物界中介于藻類與蕨類植物之間，是僅次于種子植物的第二大植物種群，在自然界中分布廣泛。苔類植物富含大量的次生代謝產(chǎn)物，主要是萜類以及多酚類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，具有抗腫瘤、抗真菌、抗氧化以及昆蟲拒食等廣泛的生物活性。但是由于苔蘚植物本身個(gè)體較小以及生長環(huán)境復(fù)雜多樣，對其進(jìn)行采集困難重重，對其中分離得到的活性較好的化合物，在短期內(nèi)難以進(jìn)行大量的富集，用于進(jìn)一步的研究，這極大地限制了新藥研發(fā)的步伐。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，代謝

2、工程以及合成生物學(xué)的應(yīng)用，為解決該問題提供了一個(gè)途徑。苔類植物中富含大量比較獨(dú)特的的雙聯(lián)芐類化合物以及特殊結(jié)構(gòu)的萜類化合物，然而對于其生物合成反應(yīng)催化的關(guān)鍵酶研究還比較少，因此，探尋苔類植物中催化產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶，闡明一些重要次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，通過組合生物合成的方法得到目標(biāo)化合物或者通過基因改造的手段來提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量，已經(jīng)成為解決活性化合物來源的一個(gè)重要途徑。
　　本文通過從幾種苔類植物轉(zhuǎn)錄組測序以及cDN

3、A文庫中，篩選出了幾個(gè)與萜類以及多酚類生物合成相關(guān)的基因進(jìn)行研究。包括二萜合酶(diTPS)，從萜類含量豐富的蛇苔中克隆獲得兩個(gè)二萜合酶，并對其功能進(jìn)行了初步的研究;酚酸脫羧酶(PAD)，從小蛇苔中克隆得到了一個(gè)PAD基因，對其體外功能以及基因定位進(jìn)行了研究;對羥基肉桂酰輔酶A連接酶(4CL)，從鈍鱗紫背苔以及粗裂地錢中總共克隆得到了7個(gè)4CL基因，對其體外功能以及非生物脅迫下表達(dá)量隨時(shí)間的變化關(guān)系進(jìn)行了研究，同時(shí)挑選了活性較好的兩個(gè)基

4、因轉(zhuǎn)入擬南芥中，對轉(zhuǎn)基因植株中黃酮以及木質(zhì)素的含量進(jìn)行了分析，對其在植物體內(nèi)的功能進(jìn)行了研究。主要的研究內(nèi)容以及結(jié)果如下:
　　1.蛇苔中二萜合酶基因的克隆和功能研究
　　本文從蛇苔(Conocephalumconicum)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到兩個(gè)二萜合酶，通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，他們分別注釋為焦磷酸古巴酯合酶(CPS)以及對映貝殼杉烯合酶(KS)，分別命名為CcCPS和CcSS。CcCPS與擬南芥的AtCPS以及

5、小立碗蘚的PpCPS/KS具有較高同源性，而且都能夠找到CPSs保守的功能域DXDD，屬于ClassⅡ型二萜合酶。CcSS具有保守的功能域DDXXD，屬于ClassⅠ型二萜合酶。對其進(jìn)行進(jìn)化地位分析，發(fā)現(xiàn)CcCPS和CcSS都與已報(bào)道的其他三種苔蘚植物的二萜合酶歸為一簇。將它們N端的轉(zhuǎn)運(yùn)肽去掉，并構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到重組蛋白。以焦磷酸香葉基香葉酯(geranylgeranyldiphosphate，GGPP)

6、為底物，對目的蛋白進(jìn)行體外酶活測定，結(jié)果表明，CcCPS能夠催化GGPP生成對映-柯杷酰焦磷酸(ent-CPP)，CcSS則催化ent-CPP生成對映海松烷型二萜(ent-sandaracopimaradiene)以及對映貝殼杉烷型二萜(ent-kaurene)兩種不同結(jié)構(gòu)類型的二萜化合物，其中以對映海松烷型二萜化合物為主要的酶活產(chǎn)物。
　　2.苔類植物中對羥基肉桂酰輔酶A連接酶(4CL)基因的克隆和功能研究
　　4CL是苯

7、丙烷代謝途徑上的第三個(gè)酶，也是調(diào)控苯丙烷代謝途徑方向的關(guān)鍵酶。本文從苔類植物cDNA文庫以及轉(zhuǎn)錄組測序中，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)注釋為對羥基肉桂酰輔酶A連接酶(4CL)的序列，將其進(jìn)行克隆得到全長。其中鈍鱗紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)中有3個(gè)，分別命名為Pa4CL1-3;粗裂地錢(Marchantiapaleacea)中克隆得到4個(gè)基因，命名為Mp4CL1-4。
　　將這些基因分別構(gòu)建到大腸桿菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)，

8、得到重組蛋白，并進(jìn)行體外酶活反應(yīng)，測定其功能。研究發(fā)現(xiàn)Pa4CL1、Pa4CL2、Mp4CL1以及Mp4CL2都能夠以對羥基肉桂酸為最佳底物，生成對羥基肉桂酰輔酶A，同時(shí)能夠催化二氫對羥基肉桂酸生成雙聯(lián)芐類化合物的前體dihydro-p-coumaryol-CoA，但是其催化活性以及底物的選擇性有所差異，Pa4CL3以及Mp4CL3、Mp4CL4則沒有檢測到催化活性。同時(shí)為了探究關(guān)鍵氨基酸對底物選擇性以及活性的影響，我們對Pa4CL1進(jìn)

9、行了點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)氨基酸Met-247以及Ala-251參與底物的催化，與蛋白對底物的結(jié)合能力有關(guān)，跟底物的選擇性沒有必然關(guān)系。
　　將Pa4CL2以及Mp4CL1轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，對轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素以及黃酮類化合物的含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)Pa4CL2以及Mp4CL1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中木質(zhì)素的含量明顯增加，黃酮類化合物的含量則有所減少。對Pa4CL1以及Mp4CL1用茉莉酸甲酯、水楊酸以及脫落酸等進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)量受到非

10、生物脅迫因子的誘導(dǎo)。Pa4CL1、Pa4CL2、Mp4CL1以及Mp4CL2定位在細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中。
　　3.小蛇苔中酚酸脫羧酶(PAD)基因的克隆和功能鑒定
　　本文從小蛇苔(Conocephalumjaponicum)的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與微生物中酚酸脫羧酶同源性較高的序列，將其克隆并命名為CjPAD，這是首次從植物當(dāng)中克隆得到的酚酸脫羧酶基因。該基因序列長度大約是微生物酚酸脫羧酶基因序列的二倍，同時(shí)具有4個(gè)

11、酚酸脫羧酶保守的催化位點(diǎn):Tyr-60，Tyr-62，Arg-90以及Glu-114。為了進(jìn)一步研究其功能，我們將該基因分別在N端和C端進(jìn)行了截短，并與原長序列一起分別構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)得到了相應(yīng)的重組蛋白。以酚酸類化合物為底物對其進(jìn)行了體外酶活功能研究，發(fā)現(xiàn)CjPAD能夠催化對羥基肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸以及芥子酸等，生成相應(yīng)的乙烯基化合物，截短后的蛋白則失去了活性，不能夠催化這些酚酸化合物。同時(shí)構(gòu)建了全長G