橘核檸檬苦素類化合物生物合成功能基因的克隆、表達(dá)及成分積累研究.pdf

1、橘核的主要藥理活性成分為檸檬苦素類化合物。課題從檸檬苦素類化合物生物合成路徑的中、下游階段選擇了三個(gè)功能基因開(kāi)展深入研究——克隆、分析、表達(dá)了角鯊烯合成酶基因、角鯊烯環(huán)氧酶基因、檸檬苦素葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，分析了檸檬苦素類化合物成分在莖（韌皮部）、葉片、果皮、種子（胚）等器官的積累規(guī)律，為檸檬苦素類化合物生物合成機(jī)制和轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　1.樣本總RNA提取、功能基因克隆和生物信息學(xué)分析
　　采用Omega試劑盒

2、用于樣本總RNA提取并進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)純度符合要求的RNA逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)同源基因參考序列設(shè)計(jì)特異性引物，考察PCR條件，得到PCR產(chǎn)物，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，從大紅袍Citrus reticulata‘Dahongpao’成熟種子（胚）中成功克隆獲得了ss、se、lgt基因序列。
　　對(duì)關(guān)鍵功能基因序列進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化分析，并對(duì)其所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列比對(duì)，一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，開(kāi)放閱讀框識(shí)別、疏水性圖譜預(yù)測(cè)，信號(hào)肽切割位點(diǎn)

3、，對(duì)檸檬苦素類化合物生物合成路徑中功能基因和關(guān)鍵酶進(jìn)行進(jìn)一步的了解和分析，清楚其結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)。
　　2.檸檬苦素類化合物生物合成過(guò)程中功能基因的表達(dá)
　　建立了大紅袍樣本的real-time PCR表達(dá)方法，得到了ss、se、lgt三個(gè)基因在莖（韌皮部）、葉、果皮、種子（胚）四個(gè)不同器官的基因相對(duì)表達(dá)量。
　　三個(gè)基因在種子（胚）中的主要表達(dá)趨勢(shì)為ss＞se＞lgt；三個(gè)基因在同一器官中的表達(dá)變化趨勢(shì)基本相同；四個(gè)不同器

4、官中主要基因表達(dá)變化時(shí)期為種子成熟期，種子形態(tài)建成末期和脫水期基因表達(dá)變化程度較小。
　　繁殖器官種子（胚）和果皮中基因表達(dá)情況基本相似，均為成熟期三個(gè)基因表達(dá)先上升后下降，存在一個(gè)最高表達(dá)時(shí)期，形態(tài)建成末期和脫水期三個(gè)基因表達(dá)量較低；而營(yíng)養(yǎng)器官莖（韌皮部）和葉片中基因表達(dá)情況基本類似，均為形態(tài)建成末期三個(gè)基因表達(dá)先下降，再上升至最高值，存在一個(gè)高表達(dá)階段，成熟期三個(gè)基因表達(dá)上升、下降再上升至次高值，脫水期三個(gè)基因的表達(dá)較低。

5、r>　　3.有效成分在各器官積累規(guī)律研究
　　采用UPLC法對(duì)不同時(shí)期所收集樣本中的檸檬苦素、諾米林、黃柏酮進(jìn)行了含量測(cè)定，對(duì)其積累和轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律進(jìn)行了初步研究。
　　檸檬苦素類成分在種子（胚）中分三個(gè)階段逐漸積累，形態(tài)建成末期先下降再上升至第一個(gè)次高值，成熟期先上升至第二個(gè)次高值后下降，脫水期快速積累達(dá)到最高值。檸檬苦素類化合物在種子（胚）中的含量較高，其含量在干燥期達(dá)到最高，推測(cè)種子（胚）可能是檸檬苦素類化合物的最終儲(chǔ)存位置

6、，果實(shí)完全成熟（12月中旬）前后為橘核藥材的最佳采收期之后有效成分含量急劇下降。
　　三個(gè)成分在四個(gè)不同器官中變化趨勢(shì)基本一致，且大小次序均為檸檬苦素＞諾米林＞黃柏酮。在130天果實(shí)和種子發(fā)育成熟階段，繁殖器官（種子）中有效成分總含量為升高趨勢(shì)，營(yíng)養(yǎng)器官（莖、葉片）中有效成分總含量變化不明顯。推測(cè)有效成分可能是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)器官不斷向繁殖器官轉(zhuǎn)運(yùn)，并在繁殖器官中積累。
　　4.基因表達(dá)量與成分積累的灰色關(guān)聯(lián)度分析
　　采用D

7、PS軟件對(duì)基因表達(dá)量和有效成分之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，種子（胚）中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮各個(gè)有效成分含量積累貢獻(xiàn)最大的均為lgt基因，其次為ss和se基因。lgt主要是在檸檬苦素類化合物生物合成的下游階段，催化檸檬苦素類化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的葡萄糖苷過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　莖（韌皮部）、葉片中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮各個(gè)有效成分含量積累貢獻(xiàn)值最大的均為ss基因，其次為se和lgt基因。ss和se主要在檸檬苦素類化合物生物合成中游階段即角