蘋果bHLH轉(zhuǎn)錄因子MdTTL1對低溫誘導(dǎo)花青苷合成和果實著色的多途徑調(diào)控.pdf

1、果實的顏色是果樹重要的農(nóng)藝性狀，決定了蘋果等果樹的食用和市場價值。蘋果果皮的顏色是由花青苷決定的。花青苷的合成受光照、溫度和營養(yǎng)等環(huán)境因素的影響。在過去一個世紀(jì)中，全球氣溫不斷升高。這種氣候的變化已經(jīng)影響到了蘋果的著色。所以，闡明低溫誘導(dǎo)或高溫抑制蘋果果實著色的分子機(jī)理對于蘋果的生產(chǎn)至關(guān)重要。
　　 本文以新紅星蘋果（Malus Domestica Borkh cv.Starkrimson）果實為試材，利用差異篩選的方法，克隆到

2、一個低溫響應(yīng)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，命名為MdTTL1（GeneBank登錄號為JF920725）。cDNA全長2687bp，編碼710個氨基酸，保守域分析表明，MdTTL1蛋白含有bHLH（basic Helix-Loop-Helix）功能域。將該蛋白與擬南芥所有的bHLH蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)MdTTL1與Ⅲf亞組調(diào)控類黃酮和表皮細(xì)胞命運的蛋白聚為一類，并與AtTT8同源性最高，所以命名為MdTTL1（TT8 like1）。進(jìn)一步分析

3、表明，MdTTL1與蘋果MdbHLH3、葡萄VvMYC1、矮牽牛PhAN1等多種植物中調(diào)控花青苷代謝的bHLH蛋白同源性最高。
　　 RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，MdTTL1在蘋果果實、幼葉、莖中都有表達(dá)，但在著色的果皮中表達(dá)量最高；并且受低溫的誘導(dǎo)。根據(jù)抗原決定簇預(yù)測分析和生物學(xué)軟件序列比對結(jié)果，選取一段編碼蛋白，合成多肽作為抗原制備抗體。Western blot 檢測結(jié)果表明，MdTTL1在UV17℃處理下蛋白表達(dá)升高和UV27℃

4、下蛋白呈降解趨勢。
　　 酵母雙雜和雙分子熒光互補(bǔ)分析表明MdTTL1能夠與MdMYB1互作，剪切試驗發(fā)現(xiàn)N-端1-228個氨基酸是與MdMYB1互作的必需區(qū)域。另外，EMSA和ChIP離體和活體兩種方法證明MdTTL1與MdUFGT和MdDFR的啟動子結(jié)合，進(jìn)一步的啟動子瞬時表達(dá)和GUS穩(wěn)定表達(dá)分析表明，MdTTL1蛋白正調(diào)控MdUFGT啟動子，并且在低溫下促進(jìn)作用更強(qiáng)。
　　 為了進(jìn)一步確定MdTTL1在蘋果內(nèi)的功能

5、，我們構(gòu)建了pBI121-MdTTL1和pBIN-MdTTL1-GFP過量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化嘎拉組培苗和王林愈傷組織。用低溫和UVB處理轉(zhuǎn)基因愈傷，分析了轉(zhuǎn)基因愈傷的花青苷變化趨勢和MdTTL1的蛋白表達(dá)水平，表明MdTTL1轉(zhuǎn)基因愈傷在UVB存在的條件下可以積累花青苷，并且在低溫下花青苷含量表達(dá)上升。蛋白表達(dá)水平變化不大，由此可以推斷MdTTL1存在翻譯后修飾。Western blot結(jié)果證明MdTTL1在低溫下發(fā)生了蛋白

6、磷酸化，并且這種低溫誘導(dǎo)的磷酸化可以被星孢菌素（10μm stau）所抑制。轉(zhuǎn)基因嘎拉明顯增加了根內(nèi)的花青苷含量，并且在低溫下花青苷含量更高。另外，轉(zhuǎn)基因組培苗還有矮化的表型，ChIP實驗表明，MdTTL1結(jié)合到MdCBF2和MdCBF3的啟動子上。為了證明MdTTL1在蘋果果實著色過程中的功能，利用瞬時表達(dá)載體IL-60-BS將其在新紅星果皮中過量表達(dá)能夠促進(jìn)注射孔周圍的著色進(jìn)程，抑制其表達(dá)抑制了注射孔周圍的著色，由此說明MdTTL1