小鼠bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族預測及其大腦調(diào)控網(wǎng)絡的構建.pdf

1、基因的表達調(diào)控是功能基因組研究的一個核心組成部分.轉(zhuǎn)錄因子與DNA順式元件相結合,進而激活下游靶基因是轉(zhuǎn)錄反應發(fā)生和基因表達的關鍵步驟之一.很多的疾病被發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄因子的變異有關,這也可能是由轉(zhuǎn)錄因子變異引起的調(diào)控網(wǎng)絡的變化所導致的.目前在人、鼠等的模式生物中仍有約50﹪的轉(zhuǎn)錄因子尚未被確定.作為研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程的內(nèi)容之一,識別轉(zhuǎn)錄因子的重要性是顯而易見的.在基因組水平上確定轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄因子家族的范圍也是構建和了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡的重要

2、前提工作.堿性/螺旋-環(huán)-螺旋(basic/Helix-Loop-Helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族是真核生物體內(nèi)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子超家族.該轉(zhuǎn)錄因子超家族廣泛存在于從酵母到人類的所有真核生物中,并在細胞增殖、決定和分化過程中發(fā)揮著重要作用.bHLH功能域大約60個氨基酸,包含了約15個氨基酸的堿性區(qū)和被一個可變長度的Loop區(qū)連接兩個α-螺旋區(qū).與DNA結合的堿性區(qū)的堿性氨基酸含量較高,HLH功能域通常先形成同源或異源二聚體或多聚體,

3、然后由堿性區(qū)與靶基因DNA上的特定六堿基序列結合.在全基因組水平上對bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子的預測工作已經(jīng)在線蟲、果蠅、酵母、人類、擬南芥和水稻中完成.小鼠基因組測序的完成為我們?nèi)孀R別小鼠bHLH轉(zhuǎn)錄因子創(chuàng)造了令人興奮的機會.公共數(shù)據(jù)庫中大規(guī)模的基因表達芯片數(shù)據(jù)也為我們構建轉(zhuǎn)錄因子控制的調(diào)控網(wǎng)絡提供了良好的信息基礎. 本論文的研究工作主要包括如下內(nèi)容: 1.小鼠bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族預測的DP優(yōu)化:在已有預測模式的基礎之上,

4、通過對BLAST的查詢序列的擴展性選擇和預測打分過程的動態(tài)規(guī)劃實現(xiàn),提出了優(yōu)化后的預測小鼠bHLH蛋白的BLAST-DP法.應用BLAST-DP法首次預測了測序完成后的小鼠基因組中bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族,分析確定的124個小鼠bHLH轉(zhuǎn)錄因子.28個蛋白是前人研究中尚未發(fā)現(xiàn)的新成員,特別是有10個非典型預測蛋白(uncharacterized putative protein) 很可能就是新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子.預測模式中保守位點的比較結果說明

5、:與擬南芥相比,大部分位點上,小鼠的保守度大于擬南芥.124個小鼠bHLH蛋白通過公認的命名法和進化分析被劃分到六個不同的子類(A～F).超過三分之二的小鼠bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白都屬于A類或B類.打分情況顯示預測模型對鑒定A類、B類和E類蛋白是相當準確的,但對另外兩類的準確度稍微欠佳.我們從蛋白功能分析中發(fā)現(xiàn)70﹪的小鼠bHLH蛋白在basic區(qū)包含Glu-9/Arg-12殘基對,也就擁有識別CANNTG的基序.位于23位的形成二聚結構所

6、必需的亮氨酸 (Leu) 在小鼠bHLH蛋白中保守度高達97﹪.GO(Gene Ontology)的統(tǒng)計分析顯示:bHLH蛋白主要參與細胞分化和細胞發(fā)育過程.本論文首次對bHLH蛋白的各類進行了功能富集性統(tǒng)計分析.結果表明歸屬于各類的蛋白傾向于擁有特定的生物功能.最大的A類bHLH蛋白在細胞命運確定 (cell fatecommitment) 和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中扮演重要角色.B類蛋白調(diào)控細胞周期,具有DNA結合活性.信號傳導、轉(zhuǎn)移酶活性、

7、轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白活性、刺激反應在C類蛋白中顯著富集.只有心臟發(fā)育在D類bHLH蛋白中顯著富集.E類蛋自在血管形成過程中發(fā)揮重要作用.F類蛋白有陽離子結合,尤其是鋅離子結合活性.很顯然,不同的蛋白類有特定的功能傾向.我們從中可以看出,bHLH蛋白序列的相似導致了它們功能的相似.這樣,小組內(nèi)那些新發(fā)現(xiàn)或性能尚不明確的蛋白成員的生物功能就可以從小組的功能富集性進行推斷. 2.bHLH轉(zhuǎn)錄因子隱馬爾可夫模型的建立:為了建立適合所有真核生物

8、的bHLH的預測模型,我們首次使用剖面隱馬爾可夫模型 (Profile Midden Markov Models,PHMM)的機器學習算法構建了bHLH蛋白的預測模型bHLH-HMM.構建新模型的原因是BLAST-DP物種特異性太強.雖然我們的BLAST-DP法是對原有BLAST方法做了優(yōu)化和改進,但由于BLAST自身打分矩陣的特征,所有基于BLAST的預測bHLH蛋白的方法都存在物種應用范圍太窄的問題.這樣在對新物種的分析就受到了限制

9、.此外,針對小鼠基因組或蛋白質(zhì)組建立的方法流程并不一定適合其它物種.而且查詢序列或序列集的選擇受個人經(jīng)驗的影響較大,預測的結果可能隨研究者的不同而不同.為了克服上述種種不足,我們將試驗確定的真核bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為隱馬爾可夫模型的訓練集,經(jīng)過模型建立和模型校準兩步建立了預測真核生物的bHLH蛋白的隱馬爾可夫模型.模型的性能評估結果顯示隱馬爾可夫模型在預測敏感度和準確度方面明顯優(yōu)于所有基于BLAST的方法.為了用新建立的bHLH-HMM發(fā)

10、現(xiàn)更多的小鼠bHLH轉(zhuǎn)錄因子,我們bHLH蛋白隱馬預測模型對小鼠蛋白質(zhì)組再次進行了分析,結果有113個蛋白達到了判定閾值,其中一個bHLH蛋白被新發(fā)現(xiàn).經(jīng)比較,與BLAST-DP法的結果有95﹪相同.為了獲得同源基因信息,我們對人類和大鼠的蛋白質(zhì)組也進行了分析,并采用best-best的方法與小鼠的bHLH因子進行了同源關系的確定.同時,分別得到107人類bHLH轉(zhuǎn)錄因子和109個大鼠bHLH轉(zhuǎn)錄因子.值得注意的是對大鼠bHLH轉(zhuǎn)錄因子

11、家族目前尚未見其它的研究報道.通過上述兩種預測方法,我們在小鼠的蛋白質(zhì)組中找到了共計125個bHLH轉(zhuǎn)錄因子.此外,由于小鼠、大鼠和人類是哺乳動物的典型代表.本論文首次通過對小鼠、大鼠和人類的bHLH蛋白的進化分析,將哺乳動物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子分為30個家族(bootstrap值>35﹪).每個家族依據(jù)所包含的亞家族或其中最為熟知的成員而被命名.30個家族的規(guī)模大小不同,最小的如CLOCK,僅有3個成員蛋白;最大的HEY族包含了38個蛋

12、白.較大的家族又可細分為更多的亞家族.平均每個家族包含約11個蛋白.在進化樹上,有一個功能未知的家族(UNKNOWN)被發(fā)現(xiàn)并有很高的支持度.bHLH蛋白家族在三個物種中都比較保守,并沒有發(fā)現(xiàn)僅在一個物種出現(xiàn)的bHLH蛋白家族,這可能是因為小鼠、人和大鼠的進化關系比較近的緣故. 3.小鼠腦中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡預測:確定轉(zhuǎn)錄因子的一個主要目的就是構建它們所控制的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡.很多研究報道bHLH蛋白是參與調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)(

13、central nervous system,CNS)的發(fā)育過程非常重要的轉(zhuǎn)錄因子家族.為了研究bHLH轉(zhuǎn)錄因子在小鼠腦中的調(diào)控機制,基于我們的轉(zhuǎn)錄因子預測結果和已有的報道,我們第一次通過基因芯片表達譜和模塊網(wǎng)絡算法進行了小鼠腦中bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡的推斷.經(jīng)過層層篩選和分析,最終推斷所得的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡包含了5個重要的bHLH轉(zhuǎn)錄因子和153個靶基因.整個網(wǎng)絡根據(jù)其表達譜被分為28個調(diào)模塊.每個模塊的靶基因數(shù)目從1到18不等.每個模

14、塊根據(jù)最富集的第4層GO分類來給定一個特定的名稱.眾多的調(diào)控模式顯示了所構建的網(wǎng)絡的復雜性和多樣性.此外,26對協(xié)作因子也在調(diào)控網(wǎng)絡中被發(fā)現(xiàn).轉(zhuǎn)錄因子間的協(xié)作體現(xiàn)了因子間可能存在的物理互作或遺傳調(diào)控.令人感興趣的是,像Neurod6和Hey2這樣的積極因子調(diào)控著多個模塊.它們共同調(diào)控了表達方式不相同的蛋白激活酶催化模塊、細胞形態(tài)生成模塊和胚胎上皮生成模塊.兩個轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄因子角色和靶基因的角色在不同的模塊里面發(fā)生了交換,而且在表達上出

15、現(xiàn)了"交互抑制"的現(xiàn)象.我們發(fā)現(xiàn)在Hey2和Neurod6本身的蛋白序列也為它們結合相同的目的基因和彼此相互結合提供了可能性.在對預測出的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡的有效性評價過程中,網(wǎng)絡內(nèi)超過75﹪的轉(zhuǎn)錄因子-靶基因?qū)Ρ粏訁^(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結合位點的匹配所驗證.在PubMed中的文獻挖掘又為5個模塊的調(diào)控關系提供了可信的支持.更重要的是,在最大的模塊中,關鍵元素間的調(diào)控關系被轉(zhuǎn)錄因子敲除突變試驗所證明.這個轉(zhuǎn)錄因子在其它兩個模塊的調(diào)控作用同樣得到了試驗

16、驗證.這樣看來,我們的調(diào)控網(wǎng)絡對了解bHLH轉(zhuǎn)錄因子在小鼠腦的生長發(fā)育和功能發(fā)揮過程中的角色具有非常重要的參考價值,同時也能為進一步的試驗研究給出了指導性數(shù)據(jù). 綜上所述,本論文針對bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族,利用小鼠基因組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和基因表達芯片數(shù)據(jù),充分使用生物信息學的方法和手段進行bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的預測和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡構建.我們的研究結果提出更可靠便捷的專門預測小鼠bHLH蛋白的BLAST-DP法,同時應用剖面隱馬爾可夫算

17、法建立適合所有真核生物的bHLH蛋白的預測模型bHLH-HMM.隨后,用這兩種方法在蛋白質(zhì)組中預測小鼠bHLH轉(zhuǎn)錄因子,進行了分類、進化、功能和同源基因確定等方面的分析. 最后利用我們的預測結果和腦組織基因表達芯片構建bHLH轉(zhuǎn)錄因子在小鼠腦中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡,并進行了模塊化、網(wǎng)絡特性以及有效性評價、試驗驗證等研究.我們的研究結果不僅將極大推進小鼠轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理的研究進展,也為人類相關疾病的分子生物學研究提供重要參考.此外,論文中研