番茄YABBY家族轉(zhuǎn)錄因子的克隆、表達模式分析及其功能研究.pdf

1、YABBY蛋白家族是一種植物中所特有的轉(zhuǎn)錄因子,具有典型的N端C2C2型鋅指結構域和C端螺旋環(huán)螺旋YABBY保守結構域,在大多數(shù)的高等植物的生長發(fā)育以及形態(tài)建成方面發(fā)揮著重要的生物學功能。目前,該家族基因在模式生物擬南芥中的功能研究比較清楚,但在番茄中分子機制仍不是很清楚,研究YABBY家族基因在番茄生長發(fā)育進程中的生物學功能具有重要意義。本研究篩選了番茄YABBY家族中的幾個緊密相關的轉(zhuǎn)錄因子分別命名為SlYABBY5、SlYABBY

2、1b和SlYABBY2a,利用qRT-PCR技術研究了此三個基因在番茄各組織中的表達模式分析;在ABA、ASA、IAA、GA3等外源激素處理以及低溫、高鹽和葉傷害等逆境脅迫下的表達分析。此外,分別構建了SlYABBY1b和SlYABBY2a基因的沉默表達載體,以及SlYABBY2a超表達載體,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法分別將SlYABBY1b和SlYABBY2a所構建的沉默載體和超表達載體轉(zhuǎn)入番茄基因組中,經(jīng)抗生素篩選以及PCR鑒定,獲得相應

3、的番茄轉(zhuǎn)基因株系,并對轉(zhuǎn)基因番茄的生長發(fā)育進行了表型觀察,進行了相關基因的表達研究,對其功能進行初步分析。主要研究內(nèi)容和結果如下:
　　1、從NCBI數(shù)據(jù)庫中分別獲得 SlYABBY5(GenBank登錄號:AK246138)、SlYABBY1b(GenBank登錄號:AK326840)和 SlYABBY2a(GenBank登錄號:AK328263)基因序列及其所編碼的氨基酸殘基,并利用RT-PCR的方法克隆了包含完整ORF的Sl

4、YABBY5基因,克隆了用于構建沉默載體的SlYABBY1b和SlYABBY2a基因的特異片段和用于構建超表達載體的包含完整ORF的SlYABBY2a的基因。所獲得的基因片段分別連入 pGEM?-T-easy-vector克隆載體,經(jīng) PCR驗證和測序驗證,所克隆的基因片段序列正確。
　　2、提取野生型番茄AC++各組織材料以及rin和Nr突變體的果實材料的總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄酶和寡聚dT合成cDNA第一鏈。利用qRT-PCR的方

5、法進行AC++野生型番茄各組織表達模式分析,利用Nr和rin的果實成熟突變體進行果實成熟各時期表達模式分析。結果表明,SlYABBY5、SlYABBY1b和SlYABBY2a均在番茄根和莖中表達量極低,但在番茄葉組織、果實組織、萼片和花組織中均呈現(xiàn)組成型表達,在不同組織中的表達有明顯的差異;在Nr和rin果實成熟突變體中與野生型番茄相比無明顯差異,且具有類似的表達趨勢。
　　3、選取四周大小的野生型番茄葉組織為材料,利用IAA、A

6、BA、GA3和ASA等激素處理番茄幼苗,qRT-PCR方法分析表明,SlYABBY5、SlYABBY1b和SlYABBY2a三個基因的表達均受到抑制;利用低溫、高鹽和機械損傷等處理幼苗,SlYABBY1b基因的表達也受到了明顯的抑制;而SlYABBY5和 SlYABBY2a基因受低溫脅迫的抑制,而其表達水平受高鹽和葉傷害脅迫的誘導。
　　4、利用所克隆的SlYABBY1b基因的特異序列構建了RNAi介導的番茄pBIN19::SlY

7、ABBY1b沉默載體,經(jīng)PCR和酶切驗證正確后,利用農(nóng)桿菌介導的方法將沉默載體重組入番茄基因組中,經(jīng)過Kan抗性篩選以及PCR驗證的方法來篩選陽性轉(zhuǎn)基因株系,經(jīng)過驗證獲得了5個陽性的轉(zhuǎn)基因株系;利用qRT-PCR技術,檢測SlYABBY1b基因在所篩選出的所有的轉(zhuǎn)基因株系中的表達情況,檢測到該基因的表達水平均被明顯的下調(diào)。
　　5、利用所克隆的SlYABBY2a的特異基因片段構建 RNAi介導的番茄pBIN19::SlYABBY2

8、a沉默載體,利用所克隆的包含完整ORF的SlYABBY2a的特異片段構建pBI121::SlYABBY2a超表達載體,經(jīng)酶切和PCR驗證正確后,利用農(nóng)桿菌介導的方法侵染番茄子葉,分別將沉默和超表達載體重組入番茄基因組,采用Kan抗性篩選和PCR驗證的方法篩選出陽性轉(zhuǎn)基因株系,驗證分別獲得了2個超表達和5個沉默的轉(zhuǎn)基因株系;利用qRT-PCR技術檢測SlYABBY2a基因分別在超表達和沉默轉(zhuǎn)基因株系中的表達量,結果顯示,在2個超表達轉(zhuǎn)基因

9、株系中SlYABBY2a基因的表達水平均被明顯上調(diào),而該基因在沉默轉(zhuǎn)基因株系中其表達量明顯下降。
　　6、利用SlYABBY1b部分轉(zhuǎn)基因材料分別進行生長素途徑和赤霉素合成途徑相關基因的檢測,研究表明,IAA3、IAA9、ARF7、ARF8和PIN4在RNAi介導的沉默轉(zhuǎn)基因番茄中表達水平與野生型番茄相比均被下調(diào)。其中,IAA3、IAA9和ARF8的表達在轉(zhuǎn)基因株系RNAi2＃中被下調(diào)的水平比RNAi4＃株系明顯。氧化酶基因GA2