稻瘟病菌Zn2Cys6和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子功能分析.pdf

1、稻瘟病是嚴(yán)重危害全球水稻產(chǎn)量的毀滅性真菌病害，其病原物稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)由于具有典型的生活史和侵染循環(huán)，被認(rèn)為是絲狀真菌致病機(jī)理和真菌分子生物學(xué)的適宜研究對象，同時也是研究病原真菌-寄主植物互作的模式生物之一。了解稻瘟病菌的致病過程和機(jī)理對于促進(jìn)水稻稻瘟病的防治有重要作用。水稻和稻瘟病菌全基因組測序的完成為我們提供了大量的基因組信息，從這些浩如煙海的DNA信息中揭示基因的功能以及它們在時空上有序表達(dá)的機(jī)制，

2、是后基因組時代研究的趨勢。轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)的調(diào)控因子，研究轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對于全面了解稻瘟病菌生長發(fā)育及其在致病過程中的分子機(jī)制具有重要意義。本文主要對Zn2Cys6和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因在稻瘟病菌生長發(fā)育和致病過程中的作用進(jìn)行系統(tǒng)的分析。
　　Zn2Cys6家族是真菌中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，也是稻瘟病菌中基因數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族。在稻瘟病菌全基因組序列中共鑒定到163個Zn2Cys6家族基因，通過高通量基

3、因敲除方法得到104個基因的缺失突變體，系統(tǒng)地分析了此104個突變體在稻瘟病菌菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生、附著胞形成、致病性和脅迫反應(yīng)等方面的作用，其中25個基因影響產(chǎn)孢量，GCC1、MoCOD1和CONx1三個基因的突變體幾乎完全喪失產(chǎn)孢能力，菌絲塊接種水稻及大麥葉片顯示，△Mocod1完全喪失對寄主植物的侵染能力，而突變體△gcc1和△conx1仍然具有致病性;CNF1和CNF2是稻瘟病菌兩個產(chǎn)孢的負(fù)調(diào)控因子，突變體菌株對水稻的致病性嚴(yán)

4、重下降;△cca1產(chǎn)生畸形的分生孢子，孢子懸浮液對水稻無致病能力，但菌絲塊接種離體水稻葉片仍能形成病斑，表明菌絲在寄主葉片形成的附著胞能夠穿透寄主角質(zhì)層而形成侵染菌絲，繼而擴(kuò)展表現(xiàn)為外部病斑。GCC1、GPF1和GTA1基因功能的缺失導(dǎo)致菌絲生長的缺陷，其中突變體△gpf1完全喪失對水稻的致病能力。
　　bHLH家族是真核生物中高度保守的一類轉(zhuǎn)錄因子，在稻瘟病菌全基因組序列中鑒定到9個bHLH家族基因(依次命名為MoHLH1-Mo

5、HLH9)，本文對該九個基因進(jìn)行了基因敲除和系統(tǒng)的功能分析，并著重探索MoHLH6對稻瘟病菌致病過程的調(diào)控作用。突變體△Mohlh6完全喪失了對完整和損傷宿主葉片的侵染能力;通過RFP-PTS1和GFP-PTS2共定位監(jiān)測過氧化物酶體的形態(tài)和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體在突變體孢子中數(shù)量較少;尼羅紅染色和MoCAP20定位實驗證實附著胞形成過程中脂滴由分生孢子向初生附著胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和附著胞成熟過程中脂滴的降解受阻;同時發(fā)現(xiàn)△Mohlh6附著胞的膨

6、壓下降，而稻瘟病菌需要依賴足夠的附著胞膨壓才能穿透寄主表皮，因此突變體的穿透能力下降，致病能力基本喪失。通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn):Mohlh6與稻瘟病菌的激酶Osm1、CpkA和Mocmkk2和鈣調(diào)磷酸酶的調(diào)控亞基Mocnb1存在相互作用，因此該基因可能作為cAMP信號途徑、鈣調(diào)途徑和滲透調(diào)節(jié)途徑的下游轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控稻瘟病菌的生長發(fā)育。同時通過RNA-seq和bHLH結(jié)構(gòu)域的保守DNA結(jié)合位點分析，鑒定得到Mohlh6直接調(diào)控的下游基因

7、，并通過敲除分析了其中十個基因的功能，進(jìn)一步驗證了MoHLH6基因在稻瘟病菌生長發(fā)育階段的調(diào)控作用。
　　綜上所述，本論文系統(tǒng)地研究了稻瘟病菌的Zn2Cys6和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因的功能，發(fā)現(xiàn)了很多對稻瘟病菌菌絲生長、分生孢子形成、附著胞發(fā)育和侵染致病等過程必不可少的基因，并詳細(xì)分析了突變體△Mohlh6致病性喪失的原因、轉(zhuǎn)錄因子MoHLH6的上游調(diào)控激酶和下游代謝基因，較為全面地闡釋了MoHLH6基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。