玉米MYB111和MYB148轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控苯丙烷代謝途徑的初步研究.pdf

1、MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物基因組內(nèi)數(shù)量龐大、功能多樣化的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛地參與植物體的苯丙烷類物質(zhì)代謝調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)建成調(diào)控、細(xì)胞周期循環(huán)調(diào)控以及對逆境脅迫做出應(yīng)答等生理活動，在植物生長發(fā)育和抵御逆境的過程中發(fā)揮著不可替代的作用。苯丙烷代謝是植物體一條非常重要的次生代謝途徑，所有包含苯丙烷骨架的化合物都是通過這條代謝途徑生成的。苯丙烷類物質(zhì)代謝出現(xiàn)在維管植物發(fā)生分離之前，單子葉植物與雙子葉植物之間某些苯丙烷類衍生物的代謝具有進(jìn)化上的保守

2、性。苯丙烷類衍生物在植物抵御微生物入侵、環(huán)境脅迫等過程中發(fā)揮重要作用;木質(zhì)素作為保護(hù)植物細(xì)胞壁的天然屏障，賦予細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度和硬度的同時為植物提供疏水的維管系統(tǒng)，參與植物抵御真菌性病害脅迫的過程、增強(qiáng)植物抗倒伏及抗旱能力;花青素可清除植物體內(nèi)因逆境脅迫而積累的活性氧及自由基，保護(hù)植物免受因逆境脅迫而造成的氧化性損傷;原花青素積累在種子的種皮中，能加固種皮、誘導(dǎo)種子進(jìn)行冬眠、防御病原菌脅迫，保護(hù)種子不受物理及生物傷害;黃酮醇能夠吸收紫外光

3、，發(fā)揮“紫外光過濾器”的作用，防止植物體及光合作用器官受到紫外光的輻射等。
　　玉米是我國第一大作物，深入研究玉米苯丙烷代謝途徑對于通過分子手段選育高抗、優(yōu)質(zhì)玉米品種具有重要意義，但是玉米中苯丙烷代謝途徑的研究遠(yuǎn)滯后于雙子葉植物。擬南芥等雙子葉植物中的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛的參與類黃酮、木質(zhì)素等苯丙烷類衍生物的調(diào)控，為玉米中苯丙烷代謝調(diào)控的研究提供重要信息。同時本課題組前期對玉米基因組中158個R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子的分布規(guī)律

4、及進(jìn)化機(jī)制進(jìn)行了研究，并通過同源性分析、共表達(dá)分析、線性分析等方法篩選到苯丙烷代謝途徑中高度保守的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，可能參與苯丙烷類衍生物代謝的調(diào)控。本研究以玉米優(yōu)良自交系B73為材料，從中克隆到兩個R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmMYB111和ZmMYB148，并對其功能進(jìn)行了初步研究;研究結(jié)果表明，ZmMYB111和ZmMYB148可能通過激活苯丙烷代謝途徑限速酶PAL的活性來調(diào)控玉米中苯丙烷類衍生物的合成，但是具體影響到哪一種

5、苯丙烷類衍生物還需進(jìn)一步研究。本研究具體結(jié)果如下:
　　1、克隆ZmMYB111和ZmMYB148基因，得到了完整的開放閱讀框。對ZmMYB111和ZmMYB148蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148具有典型的R2R3MYB蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域。將ZmMYB111和ZmMYB148與擬南芥等植物中調(diào)控苯丙烷代謝的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建親緣進(jìn)化樹(NJ樹)并對其保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果表明

6、ZmMYB111和ZmMYB148與其他調(diào)控苯丙烷代謝的R2R3MYB有較近的親緣關(guān)系并含有保守的基序。
　　2、實(shí)時定量PCR分析ZmMYB111和ZmMYB148在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明ZmMYB111在苗期葉片、莖稈的髓部、雌花中幾乎不表達(dá)，在成熟期葉、苗期根、雄花中表達(dá)量較低，在成熟期根、胚乳、成熟種子中表達(dá)量中等，莖桿上部表達(dá)量較高，莖稈下部表達(dá)量最高;ZmMYB148在苗期葉片、莖稈的髓部、雌花中幾乎不表達(dá)，在

7、成熟期葉、雄花中表達(dá)量較低，在苗期根、莖桿上部、成熟種子中表達(dá)量中等，在成熟期根、莖稈下部表達(dá)量較高，玉米胚乳中表達(dá)量最高。
　　3、利用酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析ZmMYB111和ZmMYB148是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果顯示PGBDKT7-111和PGBDKT7-148可以在SD/-Trp/-His/3-AT/X-α-gal的缺陷型培養(yǎng)基上生長，說明ZmMYB111和ZmMYB148都具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　4、基因槍轟擊洋蔥表皮

8、細(xì)胞對ZmMYB111和ZmMYB148蛋白亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明ZmMYB148定位在細(xì)胞核中，可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá);ZmMYB111主要定位在細(xì)胞核中，但是細(xì)胞膜上也有少量熒光，說明ZmMYB111可能除了在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)之外，也許還參與細(xì)胞膜的保護(hù)或者膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。
　　5、克隆苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酸COA連接酶(4CL)的啟動子pPAL、p4CL，利用酵母單雜交實(shí)

9、驗(yàn)驗(yàn)證克隆的轉(zhuǎn)錄因子與pPAL、p4CL在玉米體外是否可以結(jié)合。結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148可以與pPAL、p4CL結(jié)合，而且ZmMYB148與pPAL、p4CL結(jié)合能力比ZmMYB111與pPAL、p4CL結(jié)合能力強(qiáng)。
　　6、PAL是苯丙烷代謝途徑的限速酶，為了進(jìn)一步驗(yàn)證ZmMYB111和ZmMYB148與pPAL的結(jié)合及對pPAL活性的影響（激活或抑制），利用基因槍轟擊玉米胚乳細(xì)胞進(jìn)行瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明Zm