毛白楊鈣離子依賴的核酸酶PtCDD基因在次生木質(zhì)部發(fā)育中的功能研究.pdf

1、木材發(fā)育是植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域研究的前沿?zé)狳c(diǎn)，具有典型的細(xì)胞程序化死亡的特征。其發(fā)育過程包括維管形成層細(xì)胞啟動(dòng)分化，細(xì)胞的迅速擴(kuò)張，次生細(xì)胞壁的沉積，最后細(xì)胞死亡四個(gè)過程。核酸酶在木質(zhì)部細(xì)胞死亡的最后階段發(fā)揮至關(guān)重要的作用。近期的研究表明SNc結(jié)構(gòu)域基因家族中核酸酶基因參與了單性花的塑造和杜仲次生木質(zhì)部發(fā)育，但在楊樹莖的次生木質(zhì)部發(fā)育中尚未發(fā)現(xiàn)該類型基因。因此，研究次生木質(zhì)部核酸酶基因的功能對(duì)于揭示次生木質(zhì)部發(fā)育的機(jī)理具有重要意義。本論文

2、著重研究了毛白楊次生木質(zhì)部發(fā)育中PtCDD基因的重要作用，研究結(jié)果為理解毛白楊木材發(fā)育的分子機(jī)理提供了重要信息。主要研究結(jié)果如下:
　　PtCDD基因序列分析表明屬于典型的SNc結(jié)構(gòu)域基因家族。RT-PCR結(jié)果表明，PtCDD基因在楊樹根、莖、葉、雄花序、雌花序和花粉等組織中均有表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)表明PtCDD基因在莖中主要是在韌皮部，形成層和未成熟木質(zhì)部表達(dá)。PtCDD啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)化84K楊后，通過GUS染色分析發(fā)現(xiàn)

3、，GUS主要在楊樹維管組織中特異表達(dá)，尤其在韌皮部，形成層和未成熟木質(zhì)部中檢測(cè)到特異的GUS信號(hào)。PtCDD基因的表達(dá)模式表明PtCDD基因可能參與了楊樹維管組織的發(fā)育。
　　通過PtCDD基因啟動(dòng)子序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子區(qū)域富含激素和環(huán)境相關(guān)的順式作用元件。分別通過激素ABA和GA，以及SA、干旱和NaCl處理PPtCDD∷GUS轉(zhuǎn)基因84K葉片，發(fā)現(xiàn)GUS的活性受到這些因素的影響。這些結(jié)果都說明PtCDD基因可能受到多種激

4、素和環(huán)境的影響而表達(dá)。
　　為了研究PtCDD基因的功能，分別在PtCDD N端和C端融合綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)行活體蛋白亞細(xì)胞定位觀察，結(jié)果顯示PtCDD蛋白C端氨基酸序列具有影響該蛋白定位的功能，而GFP-PtCDD蛋白與核定位RFP-IIP蛋白共定位結(jié)果表明，PtCDD基因的表達(dá)產(chǎn)物可以隨著時(shí)間的延伸而準(zhǔn)確的定位于細(xì)胞核中。
　　為了研究PtCDD基因在活體植物組織細(xì)胞中的功能，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，分別在煙草葉片中

5、瞬時(shí)表達(dá)PtCDD基因、PtCDD基因Ca2+結(jié)合位點(diǎn)突變和PtCDD基因SNc活性位點(diǎn)突變，觀察它們對(duì)煙草葉片細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，注射煙草葉片3d后檢測(cè)到基因的表達(dá)水平顯著升高，兩周后表達(dá)PtCDD的位置葉肉細(xì)胞發(fā)生死亡，而注射對(duì)照、Ca2+結(jié)合位點(diǎn)突變和SNc結(jié)構(gòu)域突變的位置葉肉細(xì)胞未發(fā)生死亡。這些結(jié)果表明PtCDD基因是具有Ca+離子依賴的SNc結(jié)構(gòu)域活性的DNase，可以活體內(nèi)降解基因組DNA引發(fā)細(xì)胞死亡。
　　超表達(dá)P

6、tCDD基因的84K楊轉(zhuǎn)基因植株表型分析發(fā)現(xiàn)PtCDD基因活性的增加，影響了分化側(cè)根的能力。莖的切片觀察到在第3節(jié)間超表達(dá)植株導(dǎo)管分化數(shù)目要多于野生型對(duì)照;第5節(jié)間木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)和檢測(cè)的TUNEL信號(hào)都顯著多于野生型對(duì)照;第7和9節(jié)間，超表達(dá)材料單位面積的導(dǎo)管數(shù)目要顯著多于野生型對(duì)照。這些結(jié)果都說明PtCDD基因能促進(jìn)楊樹導(dǎo)管的分化。
　　通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，抑制或降低煙草PtCDD同源基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)病毒誘導(dǎo)后煙草PtC