毛白楊PtCaM的克隆及功能分析.pdf

1、木材形成是一個(gè)受到基因嚴(yán)格調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，若通過(guò)分子育種技術(shù)來(lái)改良木材品質(zhì)，首先需要深入了解木材形成過(guò)程的分子機(jī)制，即研究控制木材形成的關(guān)鍵基因及其相互作用機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)有目的地進(jìn)行分子育種設(shè)計(jì)，最終達(dá)到調(diào)控木材形成、改良木材品質(zhì)的目的。鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）是一種分布最為廣泛，功能最為重要的鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白，作為Ca2+的細(xì)胞內(nèi)受體影響Ca2+濃度，并通過(guò)激活一系列的靶酶和非酶蛋白質(zhì)，調(diào)控由Ca2+引起的一系列生理

2、生化反應(yīng)。PtCaM在毛白楊形成層部位“高豐度表達(dá)”，表明PtCaM有可能參與樹(shù)木次生生長(zhǎng)的調(diào)控過(guò)程。為了研究PtCaM與樹(shù)木生長(zhǎng)和發(fā)育的關(guān)系，本研究克隆得到毛白楊PtCaM，通過(guò)基因工程技術(shù)研究其在楊樹(shù)中的超表達(dá)對(duì)形成層活動(dòng)和次生維管組織發(fā)育的影響。本文的主要研究結(jié)果如下：
　?。?）利用RT-PCR方法，從毛白楊形成層組織制備的cDNA中分離得到PtCaM cDNA，并進(jìn)行測(cè)序和序列分析。分析結(jié)果表明，克隆的PtCaM cDN

3、A片段總長(zhǎng)為642bp，基因內(nèi)部含有大小為447bp的完整開(kāi)放閱讀框架，可編碼長(zhǎng)度為149個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)多肽。PtCaM與胡蘿卜、毛果楊、擬南芥、玉米和小麥的CaM高度同源，同源性分別為100％、99%、99%、98%、97%。
　?。?）為了研究PtCaM對(duì)形成層活動(dòng)和次生維管組織形成的影響，構(gòu)建PtCaM超量表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化84K楊，獲得轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表明，PtCaM在轉(zhuǎn)基因植株中超量表達(dá)

4、，最高約為對(duì)照植株的11.9倍。通過(guò)表型觀察和方差分析發(fā)現(xiàn) PtCaM正義轉(zhuǎn)基因植株苗高平均比對(duì)照植株高9cm，地徑平均比對(duì)照植株大0.59cm，成熟葉的形態(tài)與對(duì)照植株相比發(fā)生明顯變化，且均差異極顯著。對(duì)楊樹(shù)莖橫切面進(jìn)行切片觀察發(fā)現(xiàn)，PtCaM正義轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)部區(qū)域的細(xì)胞層數(shù)明顯增多，但細(xì)胞體積基本沒(méi)有變化。此外韌皮部和形成層區(qū)域的細(xì)胞層數(shù)也幾乎沒(méi)有變化。這些結(jié)果說(shuō)明PtCaM的超量表達(dá)導(dǎo)致了形成層細(xì)胞的分裂從而對(duì)木質(zhì)部區(qū)域的細(xì)胞增殖