豬Sn基因鋅指核酸酶和TALEN的篩選與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是危害全球生豬養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病之一。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)具有毒力差異大、變異快和誘導中和抗體水平低等特點，疫苗接種難以獲得堅強的免疫保護。PRRSV主要感染豬巨噬細胞，主要由唾液酸粘附素(Sialoadhesin,S

2、n)和CD163兩個受體介導。與病毒蛋白相比，靶細胞上的病毒受體具有高度保守性，其基因修飾有可能阻斷不同毒株的感染，已成為抗病毒感染新的研究方向。鋅指核酸酶(zincfingernuclease，ZFN)是近年來發(fā)展起來的一種定點基因修飾技術，而轉錄激活蛋白樣效應分子核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN）則是更新的基因定點修飾技術。
　　 為了獲得針對豬Sn基

3、因的ZFN和TALEN用于體內轉基因研究，本研究用兩種策略分別設計了5對針對豬Sn基因的ZFN和1對針對豬Sn基因的TALEN，分別用體外轉錄/翻譯系統(tǒng)和大腸桿菌表達系統(tǒng)進行表達，以表達產物和含目標序列的質粒DNA進行體外消化試驗，旨在篩選具有特異裂解活性的ZFN或TALEN。經靶質粒體外切割試驗證明，5對ZFN能與靶質粒結合，并能將超螺旋質粒部分線性化，但切割活性較低。設計和合成的1對TALEN，用體外轉錄/翻譯產物進行的體外切割試驗