金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶的功能鑒定及表達(dá)調(diào)控.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起人類多種感染性疾病及食物中毒的重要病原菌之一，它導(dǎo)致的食物中毒和醫(yī)院感染已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)影響公共衛(wèi)生與健康的重要問題。耐熱核酸酶是金黃色葡萄球菌重要的毒力因子之一，同時(shí)也是分離鑒定金黃色葡萄球菌的重要判定指標(biāo)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)新的編碼耐熱核酸酶的基因nuc2和已知功能的耐熱核酸酶基因nuc1同時(shí)存在于基因組中，并能表達(dá)耐熱核酸酶的活性。本論文從nuc2耐熱核酸酶結(jié)

2、構(gòu)和特性的比較入手，圍繞新的耐熱核酸酶nuc2基因的功能鑒定展開研究，進(jìn)而以基因表達(dá)、功能鑒定、調(diào)控規(guī)律為重點(diǎn)比對(duì)分析金黃色葡萄球菌兩種耐熱核酸酶的差異，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)金黃色葡萄球菌基因組中的nuc1、nuc2基因編碼的蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建了不同種屬間Nuc蛋白的進(jìn)化樹，揭示了金黃色葡萄球菌兩個(gè)核酸酶在進(jìn)化上的差異性。結(jié)果表明，Nuc2是一個(gè)在葡萄球菌屬內(nèi)進(jìn)化較為保守的蛋白

3、，而Nuc1則可能起源于其它菌屬的水平轉(zhuǎn)移。此外，在大腸桿菌中成功表達(dá)了兩種核酸酶，對(duì)比研究了它們?cè)隗w外表達(dá)時(shí)的酶活性特征，揭示了金黃色葡萄球菌Nuc2的酶學(xué)特征:最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH值為10，是一種非特異核糖核酸酶，適當(dāng)濃度的Ca2+、Mg2+、DTT、β-mecaptoethanol、TritonX-100、Tween-20和Urea都能夠提高Nuc2的酶活性，而Zn2+、Mn2+、EDTA和SDS則是Nuc2酶活性抑制劑

4、。和Nuc1相比，體外表達(dá)的Nuc2酶活性較低，且對(duì)高溫和重金屬離子的耐受力明顯低于Nuc1，這和Nuc2蛋白結(jié)構(gòu)上不穩(wěn)定的推測(cè)結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)從序列、結(jié)構(gòu)到酶活性特征上很好地區(qū)分了金黃色葡萄球菌兩個(gè)重要的耐熱核酸酶，對(duì)新近發(fā)現(xiàn)的耐熱核酸酶Nuc2的特征作了較為詳盡的研究，為其功能應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.采用Taqman熒光定量PCR方法比較了兩個(gè)耐熱核酸酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的差異。通過對(duì)金黃色葡萄球菌不同生長(zhǎng)階段nuc1和n

5、uc2基因mRNA表達(dá)水平的比較分析，發(fā)現(xiàn)nuc1和nuc2基因在生長(zhǎng)過程中的表達(dá)模式并不相同:nuc1基因的表達(dá)在對(duì)數(shù)后期達(dá)到最大值，和耐熱核酸酶活性測(cè)定結(jié)果一致;nuc2基因則在生長(zhǎng)初期達(dá)到最大值，到對(duì)數(shù)后期反而降低。另外，通過測(cè)定金黃色葡萄球菌雙組分調(diào)節(jié)子sae的缺失突變對(duì)nuc1和nuc2基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sae基因缺失顯著下調(diào)nuc1基因的表達(dá);而nuc2基因在sae缺失突變株中表達(dá)幾乎不受影響。金黃色葡萄球菌臨床分離

6、株中的nuc1基因表達(dá)變化差異明顯，nuc2基因的表達(dá)則相對(duì)穩(wěn)定。通過研究nuc1和nuc2基因在表達(dá)上的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)nuc1和nuc2基因受到不同的調(diào)控機(jī)制調(diào)控，且nuc1基因的表達(dá)是決定耐熱核酸酶活性表型的主要因素。
　　 3.利用微生物的同源重組雙交換的遺傳原理，成功構(gòu)建了耐熱核酸酶nuc2基因單缺失突變株和nuc1、nuc2基因雙缺失突變株，并在分子水平進(jìn)行了驗(yàn)證。突變株耐熱核酸酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，nuc2基因缺失后，

7、酶活性比野生型降低，雙突變株則檢測(cè)不到耐熱核酸酶活性。構(gòu)建互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化雙突變株，互補(bǔ)菌株的酶活性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nuc1基因互補(bǔ)雙缺失突變株能使其完全恢復(fù)到野生型的酶活水平，nuc2基因的互補(bǔ)只能恢復(fù)菌株nuc1基因突變后Nuc2的酶活表型。基因突變和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確定了nuc2基因在金黃色葡萄球菌中具備耐熱核酸酶活性表達(dá)功能，也進(jìn)一步證實(shí)了nuc1基因在耐熱核酸酶活性表型中占有主導(dǎo)地位的結(jié)論。
　　 4.利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)研究了兩

8、種核酸酶基因突變后對(duì)金黃色葡萄球菌RN4220轉(zhuǎn)錄組的影響，采用連鎖轉(zhuǎn)錄及基因代謝途徑定位的新分析方法，對(duì)兩種核酸酶基因突變所影響的差異基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，nuc1基因缺失顯著影響了393個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，而nuc2的缺失顯著影響了89個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。雖然兩組基因都涉及到菌株的氨基酸代謝、糖代謝、復(fù)制修復(fù)、核酸代謝及調(diào)控因子，但在相同位置發(fā)生差異變化的基因只有20個(gè)，且調(diào)控水平都不相同。挑選21個(gè)差異基因，采用熒光定量PC

9、R驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。值得注意的是，△nuc2缺失突變株和精氨酸脫亞胺酶途徑相關(guān)的基因座均下調(diào)，和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子相關(guān)的基因座上調(diào)，連鎖調(diào)控的代謝途徑還涉及到嘌呤代謝、甘氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等氨基酸代謝途徑。△nuc1基因缺失主要下調(diào)了和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、脂代謝及毒力調(diào)控因子的連鎖基因的表達(dá)，上調(diào)了尿素酶基因及蛋白酶基因。△nuc1和△nuc2缺失突變株在轉(zhuǎn)錄水平分別調(diào)控了不同的基因表達(dá)，且各有分工。
　　 5.為了更全面了解兩

10、種核酸酶基因的突變對(duì)于細(xì)胞代謝功能的影響，利用高通量的表型分析新技術(shù)—表型芯片(PM)研究了金黃色葡萄球菌兩種耐熱核酸酶突變株和親本菌株RN4220的1100多種不同的表型，包括各種碳源、氮源、磷源、硫源的利用，對(duì)氨基酸及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝、滲透特征、pH及抗生素敏感性測(cè)試。和金葡親本株相比，△nuc2突變株的PM結(jié)果有13種表型減弱了1.5倍以上，包括對(duì)3種碳、硫源的利用，對(duì)7種氮源的利用，涉及氨基酸短肽及氨的代謝。突變株全部下調(diào)的表

11、型說明了nuc2基因?qū)瘘S色葡萄球菌細(xì)胞的生理代謝的正常進(jìn)行起著重要的作用;△nuc1突變株的差異表型有9個(gè)，涉及氮源和磷源的代謝以及6個(gè)在酸性pH下的表型變化，和nuc2突變株表型不同的是，△nuc1突變株中7種表型變化都是增強(qiáng)的，尤其是在酸性pH時(shí)突變株的生長(zhǎng)和對(duì)氨基酸的利用上。25種抗生素敏感性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，△nuc2突變株和△nuc1突變株對(duì)2-4種頭孢類抗生素的抗性有所增加，這可能與膜蛋白的表達(dá)差異相關(guān)。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果表明