致雄性不育基因—反義肌動(dòng)蛋白基因和核糖核酸酶基因（Barnase）導(dǎo)入甘藍(lán)的研究.pdf

1、該研究將致雄性不育的基因----反義肌動(dòng)蛋白基因和Barnase基因分別與不同組織表達(dá)特異啟動(dòng)子構(gòu)成嵌合基因后分別通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘藍(lán),以期獲得雄性不育轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株.主要的工作和結(jié)果如下:1.甘藍(lán)高頻再生體系的建立以甘藍(lán)的下胚軸為外植體,以MS為基本培養(yǎng)基(添加0.7％的瓊脂和3％的蔗糖),加入不同濃度和組合的激素6-BA、NAA,篩選出下胚軸不定芽分化最佳培養(yǎng)基(MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L);并比較了甘藍(lán)下胚軸

2、和子葉兩種不同外植體的分化能力,下胚軸的分化頻率高于子葉.同時(shí)進(jìn)行了甘藍(lán)不定芽的生根實(shí)驗(yàn).2.甘藍(lán)外植體分化、不定芽生長(zhǎng)以及不定芽生根對(duì)除草劑(PPT)的敏感性分析在分化培養(yǎng)基中加入濃度為2.0mg/L的PPT時(shí),外植體愈傷組織形成明顯受到抑制,形成的愈傷組織也部分死亡;當(dāng)加入的PPT濃度為2.5mg/L時(shí),外植體及部分形成的愈傷組織全部逐漸白化死亡;當(dāng)PPT濃度為3.0mg/L時(shí),外植體未形成愈傷組織就白化死亡,因此確定PPT 2.5

3、mg/L的濃度作為外植體轉(zhuǎn)化的篩選壓.3.甘藍(lán)外植體高頻轉(zhuǎn)化體系的建立在最佳培養(yǎng)基上試驗(yàn)了外植體的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、浸菌時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、選用何種抗生素抑菌以及乙酰丁香酮(AS)等因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響,建立了甘藍(lán)外植體的高頻轉(zhuǎn)化體系:以6-7天的甘藍(lán)下胚軸為外植體,分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2天,在用MS液體培養(yǎng)基稀釋的菌液中感菌3-5分鐘,共培養(yǎng)2天后,轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基1(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L+PPT2.5mg/L+Ca

4、rb500mg/L)中篩選抗性愈傷組織和抗性芽,每?jī)芍軗Q一次培養(yǎng)基.4.轉(zhuǎn)基因植株的鑒定提取轉(zhuǎn)基因植株的總DNA,分別對(duì)其轉(zhuǎn)化的目的基因(反義肌動(dòng)蛋白基因,Barnase基因),目的基因的啟動(dòng)子(TA29,NTM19)以及篩選基因(Bar基因)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,轉(zhuǎn)化植株均擴(kuò)增出相應(yīng)目的大小片段,而非轉(zhuǎn)化植株都呈陰性.結(jié)果證明致雄性不育的反義肌動(dòng)蛋白基因和Barnase基因已被整合到甘藍(lán)的基因組中.將經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)確認(rèn)的甘藍(lán)植株的葉片接種入