番茄花藥和小孢子離體培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化雄性不育基因Barnase的研究.pdf

1、番茄(Lycopersicon esculentum Mill)屬于茄科番茄屬，在世界各地廣泛栽培，僅采用常規(guī)育種手段選育番茄新品種，進(jìn)展緩慢，花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)可以獲得純系，有助于提高育種效率。同時，番茄是自花授粉作物，雜種優(yōu)勢十分明顯，番茄雄性不育的研究對其雜交育種非常重要。本文對番茄花藥培養(yǎng)與游離小孢子培養(yǎng)影響因素進(jìn)行了研究，通過花藥培養(yǎng)從‘里格爾87-5’、‘石番9號’、‘厚皮毛粉’中獲得花粉植株；首次通過游離小孢子培

2、養(yǎng)從‘里格爾87-5’、‘金冠’、‘鉆石’和‘厚皮毛粉’獲得了大量的球型胚、心型胚。同時，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對煙草和番茄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得25株轉(zhuǎn)Barnase基因煙草和20株轉(zhuǎn)Barnase基因番茄，并對轉(zhuǎn)基因植株不育性生物學(xué)特征進(jìn)行觀察。具體結(jié)果如下：
　　 1.建立了番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的實(shí)驗(yàn)體系。本研究以6個番茄品種的花藥為材料，研究了番茄花藥胚胎發(fā)生與植株再生。研究表明基因型是番茄花藥培養(yǎng)影響的決定因素，不同

3、基因型的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯不同；培養(yǎng)基中加入馬鈴薯汁、活性炭，6個品種的愈傷組織平均誘導(dǎo)率較對照分別降低了35.14％、95.48％；培養(yǎng)基中添加1.0mg/L的2，4-D和0.5mg/L的KT，‘里格爾87-5’和‘石番9號’的誘導(dǎo)率都達(dá)最高；培養(yǎng)基中加入30g/L的蔗糖，‘里格爾87-5’的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)20.24％；培養(yǎng)基中加入10μmol/L的硝酸銀，花藥組織褐化率較對照降低了70.59％。番茄花藥愈傷組織在MS+ZT1.5m

4、g/L+IAA0.2mg/L培養(yǎng)基上，不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)40％，此配方是番茄花藥愈傷組織再分化成不定芽的較優(yōu)配方；在不定芽分化的培養(yǎng)基中加入2mg/L的三十烷醇，可以提高不定芽的質(zhì)量及其分化率，顯著提高了有效芽百分比；當(dāng)不定芽長至3-4cm大小時，接入1/2MS+2.0mg/LIBA進(jìn)行誘導(dǎo)生根，獲得了番茄花粉植株。
　　 2.番茄小孢子游離培養(yǎng)獲得胚狀體的研究。本實(shí)驗(yàn)采用兩種不同方式的小孢子分離和培養(yǎng)系統(tǒng)，WM技術(shù)和SMC技術(shù)。

5、結(jié)果表明，WM技術(shù)是番茄小孢子分離和培養(yǎng)的較優(yōu)技術(shù)體系。SMC技術(shù)較WM技術(shù)相比，‘里格爾87-5’和‘金冠’的胚產(chǎn)量分別降低了53.56％、49.86％。不同基因型的胚胎發(fā)生能力差異很大。本實(shí)驗(yàn)的3個番茄品種在相同培養(yǎng)條件下，小孢子胚產(chǎn)量從高到低的依次為：‘里格爾87-5’、‘金冠’、‘鉆石’、‘厚皮毛粉’、‘002’。其中，‘里格爾87-5’、‘金冠’和’鉆石’較易形成胚狀體，而在同一培養(yǎng)條件下，‘002’的胚產(chǎn)量僅有0.13個，不

6、易產(chǎn)生胚狀體。在番茄小孢子游離培養(yǎng)過程中，加入番茄的未成熟子房，5個品種的小孢子胚產(chǎn)量都明顯高于對照。
　　 3.轉(zhuǎn)化雄性不育Barnase基因煙草、番茄植株的獲得。通過凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LB4404，獲得轉(zhuǎn)Barnase基因煙草和轉(zhuǎn)Barnase基因番茄。轉(zhuǎn)Barnase基因煙草和轉(zhuǎn)Barnase基因番茄經(jīng)卡那霉素篩選，PCR，RT-PCR檢測，表明Barnase基因已整合到煙草和番茄基因組中，并且能在植物中正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。