苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)與雄性不育差異表達(dá)分析.pdf

1、為了解雄性不育形成的分子機(jī)理，獲得苜蓿雄性不育純合系植株，進(jìn)一步提高苜蓿雄性不育雜種優(yōu)勢(shì)的利用價(jià)值，本試驗(yàn)以苜蓿雄性不育株及其對(duì)應(yīng)可育株的花蕾作為研究對(duì)象，通過花藥組織培養(yǎng)技術(shù)獲得苜蓿單倍體植株，同時(shí)利用cDNA-AFLP差異顯示技術(shù)對(duì)不同發(fā)育時(shí)期不育株和可育株花蕾的基因差異表達(dá)進(jìn)行研究，探討了苜蓿雄性不育性的基因差異表達(dá)模式，并進(jìn)一步對(duì)差異基因片段進(jìn)行氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）苜蓿雄性不育株與可

2、育株花藥組織培養(yǎng)的研究表明，在現(xiàn)蕾初期取材、不經(jīng)低溫處理的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率可高達(dá)66.7％，且培養(yǎng)條件為MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.25mg/L+ NAA0.2mg/L+ KT3mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂；適宜不育材料的分化培養(yǎng)基為 MS+ KT1mg/L+ NAA0.2mg/L+2%蔗糖+0.7%瓊脂，適宜可育材料的為 MS+ KT4mg/L+ NAA0.2mg/L+2%蔗糖+0.7%瓊脂；適合誘導(dǎo)幼苗生根的培

3、養(yǎng)基為1/2MS+ NAA0.1mg/L+2%蔗糖+0.9%瓊脂；此外，不添加激素的MS培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)玻璃化苗生根。
　?。?）在苜蓿花藥組織培養(yǎng)再生植株的倍性鑒定研究中，適宜的細(xì)胞核懸液制備方法是選擇新鮮幼苗葉片，在0.1 mol/L檸檬酸和0.2% TritonX-100組成的分離緩沖液中用刀片進(jìn)行機(jī)械切割，經(jīng)兩步離心法（800 rpm離心5 min）分離；同時(shí)，利用100～200μL濃度為50 mg/L的PI染液對(duì)材料細(xì)胞核

4、染色效果好；通過流式細(xì)胞儀對(duì)再生植株進(jìn)行倍性鑒定，結(jié)果獲得單倍體、四倍體和混倍體的比例分別為：16%、78%和6%。
　　（3）對(duì)苜蓿不育株與可育株花蕾的cDNA-AFLP技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)重復(fù)性高、多態(tài)性好，適用于苜蓿不同時(shí)期花蕾基因差異表達(dá)的研究。通過12對(duì)引物獲得1746條能夠穩(wěn)定存在的條帶，其中差異表達(dá)基因占12.37%，且包括不育性特異表達(dá)、不育性表達(dá)和育性特異表達(dá)3種類型。
　?。?）將4條苜蓿花蕾期的