毛白楊二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因在煙草中的功能驗(yàn)證.pdf

1、起源于苯丙氨酸次生代謝途徑的黃酮類(lèi)化合物是植物重要的次生代謝產(chǎn)物。參與植物的花色形成、紫外線防護(hù)、抵抗病原體，花粉發(fā)育，激素的運(yùn)輸。在植物與微生物間的互利共生作用中扮演重要作用。大量研究表明黃酮類(lèi)化合物在人體中具有多種生物活性，包括抗氧化、清除自由基、抗病毒、抗發(fā)炎、血管舒張活性等。
　　 雖然通過(guò)共同的前體物質(zhì)闡述了植物的黃酮類(lèi)化合物合成途徑，但是長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，研究重點(diǎn)主要集中于一年生草本植物擬南芥基因組中的分子信息。現(xiàn)在隨著楊

2、樹(shù)基因組序列的獲得，了解和開(kāi)發(fā)樹(shù)種的次生代謝將會(huì)實(shí)現(xiàn)。
　　 目前研究已知，楊樹(shù)的苯丙氨酸生物代謝途徑中存在基因的結(jié)構(gòu)和功能更為復(fù)雜。在楊樹(shù)和其他快速生長(zhǎng)樹(shù)種中，黃酮化合物和水楊酸酚存在許多不同形式的功能，在葉片中的含量占到總生物量的50％。從分子水平破解楊樹(shù)的次生代謝密碼，對(duì)了解次生代謝產(chǎn)物對(duì)樹(shù)木自身生長(zhǎng)及其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)多樣性的潛在影響，具有重要意義。
　　 二氫黃酮醇4-還原酶(DFR；EC1.1.1.219)是黃酮類(lèi)

3、化合物合成途徑靠后階段的關(guān)鍵酶。它催化二氫堪非醇(dihydrokaempferol，DHK)，二氫櫟皮黃酮(dihydroquercetin，DHQ)和二氫楊梅黃酮(dihydromyricetin，DHM)三種黃烷酮醇轉(zhuǎn)化為的無(wú)色花色素，可作為花青素和縮合單寧(原花色素)的前體物質(zhì)。
　　 從毛白楊中分離到兩個(gè)DFR基因的cDNA片段(PtDFR1和PtDFR2)。構(gòu)建CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控的正義表達(dá)載體pBK-DFR1-

4、S和pORE4-DFR2-S，反義表達(dá)載體pBK-DFR-As，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草后，卡那霉素50mg/L做為選擇壓，篩選出轉(zhuǎn)化植株。
　　 以野生型煙草植株為陰性對(duì)照，以攜帶外源目的基因的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以提取轉(zhuǎn)化植物基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增外源基因NPTII和DFR以鑒定轉(zhuǎn)化植株，結(jié)果表明外源基因已成功插入轉(zhuǎn)化植株基因組中。
　　 RT-PCR檢測(cè)外源基因(PtDFR)在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。

5、提取轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以18s rRNA基因?yàn)閮?nèi)參，調(diào)整cDNA模板濃度一致，擴(kuò)增外源基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(未轉(zhuǎn)化植株)相比，正義轉(zhuǎn)化植株在轉(zhuǎn)錄水平存在外源基因DFR表達(dá)，反義轉(zhuǎn)化植物外源基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)比正義相比受到明顯抑制。
　　 煙草轉(zhuǎn)化植物的花色表現(xiàn)型出現(xiàn)差異，野生型煙草的花瓣顏色為粉紅色。轉(zhuǎn)DFR1基因正義表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株，花瓣顏色明顯偏紅，有的甚至雌蕊的顏色也出現(xiàn)紅色。在轉(zhuǎn)DFR反義

6、表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株中，花瓣顏色趨于白色，僅在邊緣存在可見(jiàn)的淡粉紅色。在轉(zhuǎn)DFR2正義表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株，花瓣顏色與野生型趨于相同，不存在明顯差異。
　　 提取了轉(zhuǎn)化煙草植株中花瓣的花青素進(jìn)行HPLC分析，檢測(cè)矢車(chē)菊素3-阿拉伯糖苷單體。與野生型煙草相比，攜帶有外源基因DFR1正義載體的轉(zhuǎn)化植株，峰面積明顯增大；反義載體的轉(zhuǎn)化植株，峰面積明顯減小。攜帶有外源基因DFR2正義載體的轉(zhuǎn)化植株，峰面積差異不顯著。
　　 以蘆