稻瘟病菌亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MoMET13)功能的初步研究.pdf

1、本文利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ATMT轉(zhuǎn)化技術(shù)成功獲得一個(gè)稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)致病缺陷突變體Wh-672,并鑒定了T-DNA標(biāo)記的基因MoMET13,進(jìn)而通過敲除和互補(bǔ)驗(yàn)證對(duì)MoMET13的生物學(xué)功能做了初步分析。
　　 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(ATMT)篩選出一個(gè)對(duì)大麥和水稻都完全失去致病性的稻瘟病菌突變體Wh-672。Wh-672在CM培養(yǎng)基上菌落生長速率明顯減慢,菌落白色,無氣生菌絲,不產(chǎn)生分生孢子。采用h

2、iTAIL-PCR的方法擴(kuò)增了T-DNA右邊界的610bp基因組DNA序列,并克隆到pGEM-Teasy載體上。測(cè)序和BLAST分析結(jié)果顯示,T-DNA標(biāo)記基因編號(hào)為MGG_01728.6,該基因位于第1染色體的Supercontig27內(nèi),由1948個(gè)堿基組成,編碼627個(gè)氨基酸,內(nèi)有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子,T=DNA插入位點(diǎn)在MoMET13基因起始密碼上游815bp處。MGG_01728與Sc MET13和Sp MET9的同源性分別

3、為46.9％,48.03％,這些序列屬于亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)超家族成員。
　　 通過構(gòu)建MoMET13基因敲除載體和稻瘟病菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化得到96個(gè)轉(zhuǎn)化子,并通過PCR和Southern雜交篩選出4個(gè)MoMET13基因敲除轉(zhuǎn)化子。突變體表型分析結(jié)果表明,ΔMomet13突變體不能在缺甲硫氨酸的基本培養(yǎng)基上生長,對(duì)寄主的致病性喪失,其它表型也與Wh

4、-672突變體完全一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變體Wh-672的表型改變是由T-DNA插入引起的,構(gòu)建了融合MoMET13和綠色熒光蛋白基因GFP的互補(bǔ)載體,分別對(duì)Wh-672和ΔMomet13突變體進(jìn)行了互補(bǔ)轉(zhuǎn)化,獲得58個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。選取轉(zhuǎn)化子672-hb3進(jìn)行表型互補(bǔ)分析,結(jié)果顯示突變體的所有表型均得到恢復(fù)。通過激光掃描共聚焦顯微鏡在672-hb3的菌絲、孢子和附著胞內(nèi)幾乎都觀察不到GFP綠色熒光,說明MoMET13基因在營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢

5、和附著胞形成過程中低水平表達(dá)。
　　 生物信息學(xué)分析表明,在稻瘟病菌中除MoMET13外,MoMET12也可編碼亞甲基四氫葉酸還原酶,它們分別與釀酒酵母(S.cerevisiae)的MET13和MET12同源。為進(jìn)一步了解稻瘟病菌MoMET12基因的功能,通過構(gòu)建MoMET12基因敲除載體和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化得到269個(gè)轉(zhuǎn)化子,用PCR的方法篩選出4個(gè)敲除轉(zhuǎn)化子,ΔMomet12突變體與ΔMomet13突變體類似也不能在缺甲硫氨酸的基