葉酸拮抗亞甲基四氫葉酸還原酶基因沉默對腭突間充質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡影響的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂(Nonsyndromiccleft of the lip and／or palate，NCL／P)是常見的出生缺陷，是一種多基因易感性疾病，有著復(fù)雜的遺傳特點(diǎn)，目前研究認(rèn)為非綜合征唇腭裂的發(fā)生是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果，傾向于是繼發(fā)的基因—環(huán)境因素相互作用而形成的。5，10—亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reducetase，MTHFR)在葉酸代謝中起重

2、要作用，其功能為催化5，10—亞甲基四氫葉酸還原為5—亞甲基四氫葉酸。MTHFR基因突變可導(dǎo)致酶活力降低，使娩出的胎兒出現(xiàn)畸形，并且MTHFR基因敲除小鼠表現(xiàn)為包括唇腭裂在內(nèi)的顱面畸形。作為環(huán)境因素之一的包括葉酸在內(nèi)的多維生素孕早期的補(bǔ)充可以降低先天性唇腭裂的發(fā)生的危險。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)MTHFR基因活性喪失產(chǎn)生唇腭裂畸形，流行病學(xué)調(diào)查認(rèn)為MTHFR基因突變的人群補(bǔ)充葉酸可以預(yù)防胎兒唇腭裂的發(fā)生率。但是葉酸預(yù)防MTHFR基因突變致畸作用的機(jī)

3、制并不清楚，本文應(yīng)用RNA干擾技術(shù)從細(xì)胞水平對MTHFR基因突變致畸作用機(jī)制及補(bǔ)充葉酸拮抗MTHFR基因下調(diào)作用的機(jī)制進(jìn)行了研究。方法：首先，應(yīng)用構(gòu)建的MTHFR基因沉默載體對原代培養(yǎng)的C57BL／6J近交系小鼠的胚胎13天的腭突間充質(zhì)細(xì)胞(embryonic Palatal mesenchymal cell，EPM cell)進(jìn)行了RNA干擾(RNA interfefence，RNAi)實(shí)驗(yàn)。通過MTT法檢測了MTHFR基因沉默后細(xì)胞

4、增殖的改變，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了MTHFR基因沉默后對胚胎腭突間充質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。隨后，應(yīng)用不同濃度的葉酸補(bǔ)充，通過MTT法檢測了葉酸補(bǔ)充后拮抗MTHFR基因功能下調(diào)對細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀分析了MTHFR基因功能下調(diào)補(bǔ)充葉酸前后，細(xì)胞周期的改變。結(jié)果：MTHFR基因功能下調(diào)后，EPM細(xì)胞增殖率下降，凋亡率上升；給以不同劑量葉酸補(bǔ)充后，可以逆轉(zhuǎn)MTHFR基因功能下調(diào)對EPM細(xì)胞的不良影響。影響程度與補(bǔ)充的葉酸具有一定的劑量依賴性

5、，以20ug／ml葉酸補(bǔ)充可以最大程度拮抗MTHFR基因功能下調(diào)的不良影響。結(jié)論：原代培養(yǎng)的細(xì)胞具有胚胎腭突間充質(zhì)的特性，純化效果明確，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。MTHFR基因沉默載體構(gòu)建成功，EPM細(xì)胞MTHFR基因沉默具有特異性、高效性。MTHFR基因沉默可以引起EPM細(xì)胞增殖活力下降，并誘發(fā)凋亡，而葉酸補(bǔ)充可以拮抗MTHFR基因功能下調(diào)的不良影響。內(nèi)在機(jī)制是MTHFR基因功能下調(diào)可以使EPM細(xì)胞阻滯于G<,1>／G<,o>期，從而引發(fā)凋亡