HSF4在晶狀體發(fā)育中的作用及其突變導致白內(nèi)障的機制研究.pdf

1、熱休克因子是生物體內(nèi)的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控熱休克蛋白應對內(nèi)外環(huán)境的各種脅迫,并參與機體的多種生理功能。熱休克因子4(Heat Shock Factor4,HSF4)在晶狀體細胞中高度表達,在晶狀體的形成和分化過程中起重要的作用。HSF4突變可導致先天性和老年性白內(nèi)障的發(fā)生,但是HSF4導致白內(nèi)障的分子機理并不完全清楚。本論文從HSF4基因與DNA損傷修復、HSF4調(diào)控DNA酶DLAD,以及HSF4和p53的相互作用關(guān)系等三個全新

2、的方面,研究HSF4的功能及其突變引起白內(nèi)障的病理機制。
　　晶狀體中DNA損傷的不斷累積是老年性白內(nèi)障生成的一個重要原因,及時地清除DNA損傷對維持晶狀體的正常功能十分必要。在本研究中,我們首先發(fā)現(xiàn)HSF4能夠促進修復紫外線導致的DNA損傷和DNA鏈的斷裂,而HSF4的白內(nèi)障致病突變不具有修復這些DNA損傷的能力。Rad51是DNA同源重組修復通路中的關(guān)鍵催化酶。我們的研究發(fā)現(xiàn)HSF4通過調(diào)控Rad51起到DNA損傷修復功能:利

3、用Rad51啟動子的熒光素酶報告載體和染色質(zhì)免疫沉淀實驗,我們發(fā)現(xiàn)HSF4能直接結(jié)合在Rad51啟動子上的熱休克元件上啟動其轉(zhuǎn)錄表達,而HSF4的白內(nèi)障致病突變卻失去此功能;通過實時定量PCR和免疫印跡技術(shù),進一步證實HSF4的DNA損傷修復功能是依賴于Rad51;過表達Rad51可以回補由HSF4突變導致的DNA損傷修復障礙;喜樹堿處理能夠通過抑制Rad51表達水平的上調(diào)進而抑制HSF4的DNA損傷修復功能;在斑馬魚中利用morpho

4、lino技術(shù)敲除HSF4,導致斑馬魚中Rad51的表達減少,及晶狀體中DNA損傷增加。我們的研究首次明確表明先天性白內(nèi)障的致病基因能夠直接參與DNA損傷修復,為了解先天性和老年性白內(nèi)障形成的病理機制提供了一個全新的視角。
　　晶狀體纖維細胞的去核過程是完成晶狀體分化的必要步驟。DNase2β(DLAD)是脊椎動物晶狀體中存在的主要Dnase,在晶狀體分化過程中發(fā)揮重要功能,敲除DLAD的小鼠會出現(xiàn)核性白內(nèi)障表型。通過DLAD啟動子

5、熒光素酶報告載體和染色質(zhì)沉淀實驗,我們的研究發(fā)現(xiàn)HSF4通過直接結(jié)合在DLAD的啟動子上上調(diào)DLAD的轉(zhuǎn)錄和表達,進而促進其Dnase活性。HSF4的白內(nèi)障致病突變破壞其與DLAD啟動子的結(jié)合能力,喪失其上調(diào)DLAD表達的能力從而影響Dnase活性。在體內(nèi),我們應用morpholino抑制斑馬魚HSF4表達,發(fā)現(xiàn)HSF4下調(diào)的斑馬魚,晶狀體在分化過程中細胞核的去除不完全。與之相一致的是斑馬魚DLAD的蛋白水平和Dnase活性下降。說明H

6、SF4通過上調(diào)DLAD的表達,參與晶狀體分化的去核化過程。我們的研究結(jié)果找到了一條解釋HSF4突變導致白內(nèi)障生成的全新分子途徑,幫助我們更深入地了解HSF4在晶狀體分化中的功能。
　　應用免疫共沉淀和pulldown技術(shù),我們首次發(fā)現(xiàn)HSF4和p53存在相互作用。這個發(fā)現(xiàn)為我們研究HSF4和p53在晶狀體分化和發(fā)育中的功能,揭示相關(guān)的調(diào)控通路,為我們進一步研究HSF4和p53在白內(nèi)障生成中的分子機制提供了全新的思路。
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