抑制miRNA-21的表達(dá)對膽管癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響及其靶基因的探討.pdf

1、膽管癌是常見的膽道惡性腫瘤之一,其惡性程度高,且發(fā)病隱匿,早期診斷困難,手術(shù)切除率低。近年研究發(fā)現(xiàn)多種MicroRNA(miRNA)的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中,miRNA-21在膽管癌組織中呈高表達(dá)并起著癌基因的作用。本研究通過抑制人膽管癌細(xì)胞RBE中miRNA-21的表達(dá),觀察RBE細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的變化,并進(jìn)一步探討miRNA-21在RBE細(xì)胞中的作用機(jī)制。
　　目的:通過轉(zhuǎn)染miRNA-21抑制劑,抑制人膽

2、管癌細(xì)胞株RBE細(xì)胞miRNA-21的表達(dá),觀察RBE細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為的變化,并探討miRNA-21在膽管癌細(xì)胞中可能調(diào)控的靶基因及其作用機(jī)制。
　　方法:以人膽管癌細(xì)胞RBE細(xì)胞為研究對象,根據(jù)處理方法不同,細(xì)胞分為四組:正常細(xì)胞組(cell組)、脂質(zhì)體組(僅予脂質(zhì)體,lipo組)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無關(guān)序列, miRNA-21-NC)、miRNA-21抑制組(轉(zhuǎn)染 miRNA-21抑制劑,miRNA-21-IN)

3、。經(jīng)熒光定量PCR證實(shí)轉(zhuǎn)染成功后,應(yīng)用MTT方法檢測細(xì)胞增殖活性的變化,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化,通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲力的改變,通過熒光定量PCR技術(shù)及蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測RBE細(xì)胞中RECK,maspin mRNA及蛋白表達(dá)的改變。
　　結(jié)果:miRNA-21在經(jīng)轉(zhuǎn)染miRNA-21抑制劑后在RBE細(xì)胞中的表達(dá)得到有效抑制,熒光定量PCR結(jié)果顯示與正常細(xì)胞相比,其表達(dá)下降

4、了0.0014倍。MTT結(jié)果顯示RBE細(xì)胞在抑制miRNA-21表達(dá)后增殖活性明顯受到抑制(P＜0.05),流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示各組細(xì)胞凋亡率分別為2.29％(cell),2.43%(lipo),2.89%(miRNA-21-NC),19.35%(miRNA-21-IN), miRNA-21的表達(dá)降低后,RBE細(xì)胞的凋亡率明顯增高(P＜0.05),各組細(xì)胞Transwell小室顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為:54.0±2.1(cell),45.4

5、±3.2(lipo),40.8±2.4(miRNA-21-NC),19.2±1.5(miRNA-21-IN),實(shí)驗(yàn)組 RBE細(xì)胞相對于對照組其侵襲力明顯下降(P＜0.05)并且熒光定量 PCR及western blot結(jié)果顯示在miRNA-21抑制后,RECK, maspin mRNA及其蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:通過抑制miRNA-21的表達(dá)可抑制RBE細(xì)胞的增值,促進(jìn)RBE細(xì)胞的凋亡,降低RBE細(xì)胞的侵襲