pGEX-4T-2-TK原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達.pdf

1、目的：近年來，腫瘤的基因治療一直是人們研究的熱點。為了探索自殺基因在腫瘤治療中的應(yīng)用，本實驗選擇具有較好安全性，重組后能很好表達的原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2作為構(gòu)建重組質(zhì)粒的載體，以其表達產(chǎn)物能將無毒的前體藥物更昔洛韋（GCV）轉(zhuǎn)化成細胞毒性產(chǎn)物（三磷酸更昔洛韋）的自殺基因-單純皰疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）作為目的基因，用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)構(gòu)建pGEX-4T-2-TK重組質(zhì)粒，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）

2、內(nèi)，觀察其目的蛋白表達情況及體外對鼻咽癌CNE-2細胞的殺傷作用，為進一步轉(zhuǎn)化入雙歧桿菌后能否靶向表達于腫瘤乏氧區(qū)的后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。 方法：用小量制備質(zhì)粒DNA的方法分別提取表達型質(zhì)粒pGEX-4T-2以及含有TK自殺基因的質(zhì)粒pORF-HSV-TK，通過PCR方法以質(zhì)粒pORF-HSV-tk為摸板擴增亡TK基因，設(shè)計上下游引物時分別加入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅡ酶切點。純化后的表達型質(zhì)粒載體pGEX-4T-2與自殺基因H

3、SV-TK分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ進行雙酶切后連接。將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）內(nèi)，用含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選出陽性轉(zhuǎn)化菌菌落，擴增后再提出質(zhì)粒行雙酶切鑒定，PCR鑒定以及送英駿公司進行測序鑒定，將鑒定正確的陽性菌用IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)表達后，一部分行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察蛋白表達情況，同時另一部分添加終濃度為1mmol/L的更昔洛韋，厭氧罐厭氧培養(yǎng)24h后取細菌

4、懸液10 ml，離心收集上清液，真空干燥，殘渣用無菌0.9％生理鹽水1ml溶解，由此獲得處理液。同時以培養(yǎng)基、單純陽性菌處理液組及單純GCV組作對照，處理方法同上。各取200μl處理液作用于培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中的CNE-2細胞，于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h后，用WST-1法觀察各組鼻咽癌細胞存活率。 結(jié)果：（1）挑取抗氨芐青霉素的單個陽性轉(zhuǎn)化菌菌落，擴增后提取重組質(zhì)粒行雙酶切，然后行1％瓊脂糖凝膠電泳得到1100kb（H

5、SV-TK）和4900kb（pGEX-4T-2）片斷，與預(yù)計大小一致。（2）以提取出的重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-TK為模板，PCR特異性擴增HSV-tk基因，行1％瓊脂糖凝膠電泳，可見擴增出的PCR產(chǎn)物大小約1100Kb的條帶，與TK基因大小一致。（3）將pGEX-4T-2-HSVtk重組質(zhì)粒送Invitrogen公司進行測序鑒定，通過兩個測序反應(yīng)得到兩段堿基序列分別為854bp和872bp，去除測序引物并且連接后得到1124bp，將

6、此段連接序列用chromas軟件分析示與GENEBANK上公布的原序列一致，無開放讀碼框架移位及改變，無基因突變。（4）陽性轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，較未添加IPTG組可見目的蛋白條帶產(chǎn)生，說明構(gòu)建的原核表達質(zhì)粒成功，經(jīng)誘導(dǎo)后可以表達目的蛋白，達到實驗要求。（5）體外WST-1法觀察實驗組（陽性菌+GCV）CNE-2細胞存活率只有33.65％，而單純陽性轉(zhuǎn)化菌組及單純GCV組的存活率分別為88.29％，7

7、6.81％，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，實驗組與各對照組進行組間比較，p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。采用析因方差分析，單純陽性菌組與單純GCV組交互作用后與陽性菌+GCV組相比較，P<0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義，表明實驗組抑瘤結(jié)果，不是陽性菌組及GCV組抑瘤結(jié)果的簡單相加，而是陽性轉(zhuǎn)化菌表達的產(chǎn)物作用于前藥GCV，使其磷酸化為對細胞有毒性的三磷酸更昔洛韋，從而大大提高了對鼻咽癌細胞的殺傷作用。 結(jié)論：（1）成功構(gòu)建p