雙重靶向性抗乳腺癌融合蛋白G129R-T3原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).pdf

1、目的:
　　利用基因克隆技術(shù),將具有特異性抗腫瘤血管生成活性的腫瘤抑素(Tumstatin)的活性部位T3與具有抗乳腺癌細(xì)胞增殖作用的催乳素受體拮抗劑G129R進(jìn)行橋連,構(gòu)建新型雙重靶向性抗乳腺癌融合蛋白G129R-T3原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-G129R-T3,并在原核宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定。
　　方法:
　　首先根據(jù)人腫瘤抑素(Tumstatin)序列中編碼69-88位氨基酸的堿基序列設(shè)計(jì)合成3條重疊互

2、補(bǔ)的引物,利用重疊延伸PCR的方法分別擴(kuò)增獲得兩端帶有限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(NdeⅠ)和XhoⅠ識(shí)別序列的目的基因T3,并利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行分離純化回收。再根據(jù) GeneBank中人催乳素(prolactin，PRL)的cDNA序列用primer5.0軟件設(shè)計(jì)合成2條特異性引物,以CHEN.WY贈(zèng)與的pET22b(+)G129R-G129R為模板,分別擴(kuò)增獲得兩端帶有限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ(XhoⅠ)識(shí)別序列的目

3、的基因G129R,并利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行分離純化回收。
　　然后,根據(jù)G129R的3'端與T3的5'端BamHⅠ識(shí)別序列可重疊的特點(diǎn),以純化產(chǎn)物 G129R和T3混合作為模板,用G129R的上游引物和T3的下游引物,擴(kuò)增得到兩端帶有限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ識(shí)別序列的融合基因 G129R-T3,并利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行分離純化回收。最后,將純化回收的G129R-T3、G129R及T3片段分別克隆至pMD18-T載體,

4、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。選取陽性克隆,PCR鑒定,提取質(zhì)粒,雙酶切電泳鑒定后再次回收目的DNA片段,然后插入線性化pET22b(+)載體的NdeⅠ和XhoⅠ多克隆位點(diǎn),構(gòu)建3種原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-G129R-T3、pET22b(+)-G129R和pET22b(+)-T3。
　　將其轉(zhuǎn)化E.coli DH5α,經(jīng)DNA序列測(cè)定正確后,利用RaCC、PrositeScan、ProtParam、TMHMM、HNN和SWISS-

5、MODEL Workspace軟件對(duì)上述序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析。然后將測(cè)序成功的這3種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌BL21(DE3),利用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),然后進(jìn)行菌體沉淀收集、包涵體溶解、IDA His?Bind預(yù)裝柱平衡、細(xì)菌粗提物上樣、非特異性蛋白洗滌和靶蛋白洗脫,最后通過SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)和鑒定融合蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　凝膠電泳結(jié)果顯示我們利用PCR擴(kuò)增的方法獲得預(yù)期大

6、小的目的基因G129R-T3、G129R和T3,分別將這些目的片段純化回收后,克隆入 pMD18-T載體,經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切電泳鑒定。然后分別將雙酶切回收的目的片段插入pET22b(+)的NdeⅠ和XhoⅠ多克隆位點(diǎn),經(jīng)菌落PCR鑒定和酶切電泳鑒定后測(cè)序,結(jié)果顯示除2個(gè)同義突變外,DNA序列與 GeneBank中記載的cDNA序列完全一致,符合率為99％。應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè),G129R-T3(G129R

7、)基因編碼蛋白可能是一個(gè)非穩(wěn)定的酸性蛋白,且該蛋白為非跨膜蛋白。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后,優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,SDS-PAGE分析結(jié)果顯示目的蛋白主要以不溶性包涵體形式存在,定位于細(xì)胞質(zhì),與預(yù)期的分子量(約27kD和24kD)大小相吻合,且當(dāng)IPTG終濃度為1.0mmo1/L,37℃誘導(dǎo)4h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最大。Western blot分析表明,外源基因已經(jīng)成功地在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。
　　結(jié)論