miRNA-451a在不同心肌肥厚模型的表達(dá)及其對(duì)心肌肥厚的影響.pdf

1、背景：當(dāng)機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)紊亂、急性心肌損傷或肌節(jié)蛋白編碼基因發(fā)生突變，心臟為了適應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)生心肌肥厚。心肌肥厚的主要特征為細(xì)胞體積增大、胚胎心臟基因的重新激活，例如心房鈉尿肽（Nppa）、B型腦鈉肽（Nppb）、β肌球蛋白重鏈（Myh7）。盡管心肌肥厚早期多為一種代償性反應(yīng)，但心臟肥厚進(jìn)入失代償后會(huì)引起心力衰竭、心律失常以及心源性猝死，預(yù)后不良。
　　心肌肥厚受環(huán)境刺激及機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的共同調(diào)控。臨床上常把心肌肥厚的病因歸

2、結(jié)為前負(fù)荷增大和后負(fù)荷增大。前負(fù)荷指心肌收縮前所遇到的阻力或負(fù)荷，而前負(fù)荷增大則常見于：1）心臟瓣膜病，如二尖瓣、三尖瓣、主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全；2）先天性心臟病，如房間隔、室間隔缺損，動(dòng)脈導(dǎo)管未閉；3）全身性血容量改變，如急性大量輸液、甲亢、貧血等。后負(fù)荷指心肌收縮之后所遇到的阻力或負(fù)荷，后負(fù)荷增大常見于高血壓、主動(dòng)脈瓣狹窄、主動(dòng)脈縮窄、慢性阻塞性肺病等導(dǎo)致體肺循環(huán)阻力增大的疾病。
　　微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為18-25

3、核苷酸的小分子內(nèi)源性單鏈的非編碼RNA，第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA是由Lee等于1993年首先在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，該miRNA被命名為lineage-deficient-4(lin-4)。現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)多種miRNAs的存在，miRNA能與靶mRNA分子的3’端非編碼區(qū)的互補(bǔ)序列相結(jié)合，從而降解靶mRNA、抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)翻譯等。近年來(lái)隨著miRNA與心血管疾病方面的研究日益增多，人們發(fā)現(xiàn)miRNA參與許多心血管疾病的發(fā)生，如心律失常

4、、心肌肥厚、動(dòng)脈粥樣硬化、血管生成等。同一個(gè)miRNA可作用于多個(gè)靶基因,同一個(gè)靶基因也可被多個(gè)miRNA調(diào)控，故miRNA在生物蛋白質(zhì)合成等發(fā)揮著獨(dú)特且重要的作用。
　　Van Rooij等人首次使用芯片技術(shù)研究胸主動(dòng)脈縮窄及過(guò)表達(dá)鈣調(diào)素的轉(zhuǎn)基因小鼠兩種病理性心肌肥厚動(dòng)物模型的miRNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示兩種模型的miRNA譜大致相同。以往文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)心肌肥厚過(guò)程中，miR-1，miR-133， miR-101，miR-10a，miR

5、-221，miR-451的表達(dá)均有所下降。miR-1在心臟組織的表達(dá)非常豐富，對(duì)心臟的發(fā)育有非常重要的影響，過(guò)表達(dá)miR-1可引起心室擴(kuò)大及心力衰竭。miR-1可以與細(xì)胞骨骼調(diào)節(jié)蛋白Twf1（Twf1）相結(jié)合，它可以通過(guò)與肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合妨礙肌動(dòng)蛋白的聚合。還有報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）是miR-1的靶點(diǎn)之一，心肌肥厚模型的miR-1表達(dá)下降，而IGF-1的表達(dá)則增加。miR-133在心肌肥厚的細(xì)胞及動(dòng)物模型的表達(dá)水平均

6、呈下降趨勢(shì)，而鈣調(diào)磷酸酶的水平則明顯下降，提示鈣調(diào)磷酸酶可能為其直接靶點(diǎn)。胸主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌肥厚模型術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)芯片檢測(cè)顯示多種miRNA的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，術(shù)后第5天TAC組miR-451的表達(dá)量為假手術(shù)組的6.6％，而miR-29a則降至52.6%。
　　目的：
　　1.明確不同類型的心肌肥厚中miR-451a的表達(dá)水平變化;
　　2.觀察應(yīng)用外源性miR-451a模擬物及阻遏物后對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的效應(yīng);

7、
　　3.為miR-451a作為心肌肥厚的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法：將24只Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為2組，分為腹主動(dòng)脈縮窄（AAC）組和假手術(shù)（Sham）組。AAC組通過(guò)腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立大鼠心肌肥厚模型。建模6周后測(cè)定各組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)EF、舒張期室間隔厚度IVSd、收縮期室間隔厚度IVSs、舒張期左室后壁厚度LVPWd、收縮期左室后壁厚度LVPWs、收縮期左室內(nèi)徑LVDs、舒

8、張期左室內(nèi)徑LVDd，計(jì)算心肌肥厚指數(shù)(HWI和LVWI)，觀察心肌組織病理學(xué)變化，應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶反應(yīng)檢測(cè)大鼠左心室心肌組織miR-451a及心肌肥厚標(biāo)志分子心房鈉尿肽（ANF）、腦鈉尿肽（BNP）、β肌球蛋白重鏈（β-MHC）編碼基因的表達(dá)變化。此外，使用蛋白印跡檢測(cè)自噬標(biāo)志分子LC3 II/I（LC3)的比值。
　　1．SD乳鼠心肌細(xì)胞分為2組，即空白對(duì)照組及異丙腎上腺素組（ISO），用qRT-PCR檢測(cè)miR-4

9、51a及心肌肥厚標(biāo)志分子編碼基因的表達(dá)變化，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面積變化及蛋白印跡檢測(cè)自噬標(biāo)志分子LC3II/I的比值。
　　2．SD乳鼠心肌細(xì)胞分為4組，即miRNA mimic陰性對(duì)照（miRNA mimic Negative Control）組、miRNA inhibitor陰性對(duì)照(miRNA inhibitor Negative Control）組、miR-451a mimic組和miR-451a inhibitor組，分

10、別轉(zhuǎn)染SD乳鼠心肌細(xì)胞24h后，予ISO處理48h，用qRT-PCR檢測(cè)心肌肥厚標(biāo)志分子編碼基因的表達(dá)變化，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面積變化及蛋白印跡檢測(cè)自噬標(biāo)志分子LC3II/I的比值。
　　結(jié)果：
　　1．超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，與Sham組相比，AAC組的舒張期室間隔厚度、收縮期室間隔厚度、舒張期左室后壁厚度、收縮期左室后壁厚度、心臟肥厚指數(shù)顯著升高，收縮期左室內(nèi)徑、舒張期左室內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)則明顯下降。qRT-PCR結(jié)果顯示

11、AAC組肥厚標(biāo)志分子編碼基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于Sham組，miR-451a的相對(duì)表達(dá)量則較Sham組明顯下降。AAC組自噬蛋白LC3II/I的相對(duì)表達(dá)量明顯大于假手術(shù)組。
　　2．qRT-PCR結(jié)果顯示，ISO組SD乳鼠心肌細(xì)胞的miR-451的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組，肥厚標(biāo)志分子編碼基因相對(duì)表達(dá)量則明顯升高。免疫熒光檢測(cè)顯示，ISO組SD乳鼠心肌細(xì)胞的表面積顯著大于空白對(duì)照組。蛋白印跡檢測(cè)顯示，ISO組SD鼠心肌細(xì)胞的LC3I

12、I/I比值顯著大于空白對(duì)照組。
　　3．qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-451a mimic組SD乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)ISO處理后肥厚標(biāo)志分子編碼基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于miRNA mimic陰性對(duì)照組(PANF,Pβ-MHC均<0.01，PBNP=0.022)，miR-451a inhibitor組SD乳鼠心肌細(xì)胞則高于miRNA inhibitor陰性對(duì)照組(PBNP,Pβ-MHC均<0.01，PANF=0.021)。免疫熒光檢測(cè)顯

13、示，miR-451a mimic組SD乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)ISO處理后細(xì)胞表面積顯著低于miRNA mimic陰性對(duì)照組，miR-451a inhibitor組SD乳鼠心肌細(xì)胞表面積則高于miRNA inhibitor陰性對(duì)照組。蛋白印跡檢測(cè)顯示， miR-451a mimic組SD乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)ISO處理后LC3II/I比值顯著低于miRNA mimic陰性對(duì)照組，miR-451a inhibitor組SD乳鼠心肌細(xì)胞LC3II/I比值則高

14、于miRNA inhibitor陰性對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　1．miR-451a在AAC心肌肥厚模型及ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型表達(dá)明顯下調(diào)，伴細(xì)胞自噬活動(dòng)增加;
　　2．.轉(zhuǎn)染miR-451a模擬物能有效抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，自噬活動(dòng)減弱；相反miR-451a抑制物則加重ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，自噬活動(dòng)增強(qiáng)；
　　3．本實(shí)驗(yàn)提示miR-451a在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)揮重要作用，miR-451a可能成為心