心肌肥厚和TRP通道基因表達的研究.pdf

1、心肌肥厚是多種心臟疾病共同的病理過程。其病理變化包括心肌細胞肥大、心肌間質(zhì)細胞增殖以及心臟細胞外基質(zhì)改建等多方面的改變,即心肌重構(gòu)。心肌肥厚時心肌細胞蛋白合成增加、體積增大、直徑增寬或長度增加,肌節(jié)數(shù)量增多并伴有纖維組織增生。心肌肥厚是引起多種心血管疾病的重要危險因素。早期的心肌肥厚可能是心肌細胞對外界的刺激的一種適應性的改變,有一定的代償意義,有利于維持心輸出量,以滿足機體的需要,但是長期的心肌肥厚最終會導致心力衰竭,甚至會猝死。在心

2、肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中,細胞內(nèi)鈣內(nèi)流都起到了至關(guān)重要的作用。當壓力負荷作用與心臟或者是某些神經(jīng)體液因子(AngⅡ、ET-1和PE等)刺激時,可以導致細胞膜上鈣庫調(diào)控的鈣通道(SOC)、受體調(diào)控的鈣通道(ROC)或者電壓依賴的鈣通道(VDCC)等通道開放,使鈣離子內(nèi)流,細胞內(nèi)鈣會和鈣調(diào)素(CaM)結(jié)合,繼而激活鈣調(diào)磷酸酶(CaN),CaN的活化,又作用于NFAT通路,導致肥大基因的表達升高,進而引起心肌肥厚。
　　 TRP通道是存在

3、與細胞膜上一種重要的陽離子通道,與眾多的疾病的發(fā)生發(fā)展有重要的關(guān)系,TRP通道幾乎存在與機體的各個組織。在心臟中主要是表達的是TRPC通道,也表達部分TRPM和TRPV通道。大多數(shù)的TRP通道都可以使鈣通過。此外ROC、VDCC和SOC的開放,也可以導致鈣內(nèi)流。而TRPC通道的部分亞型被認為是組成ROC或者SOC的分子基礎(chǔ)。ROC和SOC等都與鈣內(nèi)流有關(guān),與心肌肥厚的發(fā)生密切相關(guān)。因而’TRPC通道和心肌肥厚的發(fā)生有很重要的關(guān)系。但是,

4、目前為止,對于TRP通道和心肌肥厚的關(guān)系,TRPC通道的報道較多,其他的TRP通道的亞型報道較少,其在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮作用尚未知曉,有待于進一步研究。
　　 本實驗利用Real-Time PCR的方法去研究TRPC、TRPV、TRPM、STIM1和Orai1在正常成年大鼠、新生期大鼠和心肌肥厚模型組大鼠的心肌組織中表達水平。通過與正常成年大鼠心肌組織的表達水平的比較,研究這些通道和心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的關(guān)系;另外,通過新

5、生期大鼠和正常成年大鼠和心肌肥厚模型大鼠的比較,也可以了解心臟發(fā)育與心肌肥厚的關(guān)系。
　　 第一部分大鼠心肌肥厚模型的制備和心臟功能和組織學評價
　　 目的:制各異丙腎上腺素(Iso)誘導和腹主動脈縮窄(AAC)誘導的心肌肥厚模型。
　　 方法:Iso誘導心肌肥厚模型:Iso5mg/(kg·d),背部皮下注射,連續(xù)七天,可以誘導大鼠心肌肥厚模型;AAC誘導的心肌肥厚模型:大鼠常規(guī)1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,左側(cè)臥

6、位,切開皮膚、筋膜和肌肉,游離出一段腹主動脈,然后用4＃縫合線將自制的彎曲的8＃針頭和該段腹主動脈一起結(jié)扎,再緩慢的抽出針頭,造成腹主動脈在結(jié)扎點處內(nèi)徑縮窄,然后依次復位各臟器,縫合腹壁。關(guān)籠飼養(yǎng),常規(guī)給予16萬U青霉素抗炎一周。飼養(yǎng)十二周成模。
　　 結(jié)果:血流動力學:與空白對照組比較,Iso模型組和AAC組INEDP明顯升高(P＜0.01),而LVSP和±dp/dtmax明顯下降(P＜0.01)。Iso組和AAC組兩組相比,

7、LVEDP、LVSP、±dp/dtmax則無明顯差異(P＞0.05)。心臟重量指數(shù)(HWI):與空白對照組比較,Iso模型組和AAC組心臟重量及HWI明顯升高(P＜0.01);病理學檢查:光鏡下可見,空白對照組大鼠心肌纖維排列整齊,橫紋明顯,胞核結(jié)構(gòu)清晰,無細胞腫脹;Iso組和AAC組心肌細胞顯著肥大,核大濃染,肌纖維排列紊亂,呈旋渦狀或簇狀,肌原纖維走向不一,互相交錯排列。
　　 結(jié)論:經(jīng)過Iso處理和AAC處理的大鼠均能成功

8、誘導出心肌肥厚,其中Iso造模方法相對簡單,成模率高;AAC模型類似臨床負荷性心肌肥厚的病理生理學過程。兩種方法誘導的心肌肥厚模型成功制備下一步的實驗打下基礎(chǔ)。
　　 第二部分心肌肥厚與TRIP離子通道基因表達水平的研究目的:研究正常成年大鼠、新生期大鼠、心肌肥厚模型組大鼠心肌組織中TRP通道、STIM1和Orai1 mRNA的表達水平。
　　 方法:嚴格按照Promega total RNA Isolation Sye

9、tem的方法分別提取正常成年大鼠、新生期大鼠和模型組大鼠的心肌組織的總RNA;然后根據(jù)Promega Reverse Transcription System的方法合成cDNA的第一鏈;最后根據(jù)Takara SYBR Premix Ex TaqTM熒光試劑盒的說明和cDNA的量,進行Real-Time PCR。數(shù)據(jù)分析所用的方法為2-△Ct,其中-△Ct為不同組間PCR擴增進入指數(shù)增長期的循環(huán)數(shù)的差值。
　　 結(jié)果:
　　

10、 1.BNP是心肌肥厚的標記分子之一,與正常成年鼠相比,在Iso誘導的心肌肥厚和AAC誘導的心肌肥厚模型的心肌組織中,BNP的mRNA表達水平分別升高了7.80±0.33倍和8.11±0.37倍(P＜0.01),而新生期大鼠的心肌組織中BNP的表達水平升高了8.08±0.39倍(P＜0.01)。
　　 2.TRPC1、TRPC3和TRPC6通道m(xù)RNA在心肌肥厚模型和新生期大鼠的心肌組織中表達水平均升高(P＜0.01,數(shù)據(jù)未列

11、出,詳見第二部分Table3和Table4)。上述三個通道在Iso誘導心肌肥厚模型和AAC誘導的心肌肥厚模型的表達水平無差異(P＞0.05)。TRPC2、TRPC4和TRPC5通道在三組中的表達水平無明顯差異(P＞0.05)。TRPC7在新生期大鼠的表達水平要高于其他三組(P＜0.01)。正常成年大鼠和模型組大鼠TRPC7的表達水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　 3.在正常成年大鼠組、新生期大鼠組和心肌肥厚模型組大鼠的心肌組

12、織中只探測到了TRPM4和TRPM7有表達,其他的TRPM通道均未探測到。其中TRPM4在新生期大鼠組和心肌肥厚模型組的表達水平要高于正常成年大鼠組(P＜0.01,詳見第二部分Table5和Table6)。在所有組的心肌組織中TRPM7表達水平無明顯差異。
　　 4.在正常成年大鼠組、新生期大鼠組和心肌肥厚模型組大鼠組的心肌組織中只探測到了TRPV2和TRPV6有表達,其他的TRPV通道均未探測到。TRPV2和TRPV6主要在心

13、肌成纖維細胞上有表達。和正常成年大鼠組相比,心肌肥厚模型組的TRPV2和TRPV6表達水平均升高(P＜0.01,詳見第二部分Table5和Table6)。正常成年大鼠和新生期的大鼠表達水平則無差異。
　　 5.與正常成年大鼠相比,新生期大鼠和心肌肥厚模型組大鼠的心肌組織中STIM1和Orai1的表達水平均升高(P＜0.01,詳見第二部分Tablel和Table2)。
　　 結(jié)論:在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程中,TRP通道的亞