新型融合抗菌肽基因重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建及抗菌活性研究.pdf

1、抗菌肽(antibacterical peptides，ABP)是指存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界微生物侵害，消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類(lèi)由生物細(xì)胞特定基因編碼產(chǎn)生的小分子多肽，又稱(chēng)為微生物肽(antimicrobial peptide，AMP)或肽抗生素(peptide antibiotics)(Boman HG，1991)。抗菌肽具有分子量小、對(duì)熱穩(wěn)定、抗菌譜廣、只作用于原核細(xì)胞而對(duì)真核細(xì)胞無(wú)害的特點(diǎn)，在當(dāng)前抗生素的耐藥性較為普遍，開(kāi)發(fā)一種新

2、的抗生素又極其困難的情況下，倍受人們青睞。根據(jù)已知抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能的研究，進(jìn)行新的抗菌肽的設(shè)計(jì)與改造，尋求一些具有抗腫瘤細(xì)胞和病毒、真菌、高效抗細(xì)菌的新型抗菌肽，為新藥開(kāi)發(fā)提供了新途徑。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)，將已連入原核載體pGEX-4T-1的ECD抗菌肽融合基因亞克隆至真核分泌型表達(dá)載體VR1020中，構(gòu)建了VR1020-ECD(VR-ECD)真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)菌落PCR初步篩選，BamHI/Bg/Ⅱ雙酶切及質(zhì)粒PCR鑒

3、定篩選出正確重組真核質(zhì)粒VR-ECD；測(cè)序結(jié)果比對(duì)顯示，ECD融合基因片段已正確亞克隆至真核表達(dá)載體VR1020上，為進(jìn)一步研究其生物活性奠定了可靠的基礎(chǔ)。 進(jìn)一步提取高純度VR-ECD重組真核表達(dá)載體質(zhì)粒，以真核表達(dá)載體VR1020為對(duì)照，經(jīng)JetPEI<'TM> Cationic polymer介導(dǎo)轉(zhuǎn)染真核HEK293細(xì)胞。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用離子交聯(lián)法制備了殼聚糖納米顆粒(chitosan nanoparticles，CNP)

4、，探索了CNP包裹高純度VR-ECD重組真核表達(dá)載體質(zhì)粒(CNP-VR-ECD)介導(dǎo)DNA在體外小劑量轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的效果。分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h 提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并取轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌，綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌和肺炎球菌進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，用氨芐青霉素和卡那霉素作陽(yáng)性抗菌對(duì)照。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后HEK293細(xì)胞的總RNA中均含有與目的DNA片段相對(duì)應(yīng)的mRNA，且上清液