兔瘟病毒VP60基因重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫原性.pdf

1、兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)即兔瘟，由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種烈性病毒病，特點(diǎn)是主要臟器出血，急性一般2-3天死亡，3月齡以上家兔發(fā)病率達(dá)90-100％，病死率高達(dá)95％。1984年兔瘟在我國江蘇無錫、江陰等地首次發(fā)生，快速發(fā)展到我國大部分地區(qū)，并逐步蔓延到世界各個(gè)國家，給家兔養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害。由于抗生素對兔瘟

2、治療無效，干擾素免疫調(diào)節(jié)增效作用不能徹底治愈兔瘟，目前，對兔瘟的控制以免疫預(yù)防為主，常用的疫苗是組織滅活疫苗，雖然組織滅活疫苗在控制兔瘟上發(fā)揮了重要的作用，但這種傳統(tǒng)疫苗存在成本高，易散毒、不易保存等缺點(diǎn)。相比傳統(tǒng)疫苗，基因疫苗具有安全性更高、成本更低等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)從兔瘟病毒四川株(Y8504)克隆VP60基因構(gòu)建重組真核質(zhì)粒，并對其免疫原性進(jìn)行了研究，以期為兔瘟基因疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
　　依據(jù)GenBank上公布的RHDV的V

3、P60序列設(shè)計(jì)特異性引物，使用RT-PCR擴(kuò)增RHDV的VP60基因，片段大小為1740bp，將得到的產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到pMD19-T載體，獲取重組質(zhì)粒pMD19-T-VP60，并序列測定。將測序無誤的pMD19-T-VP60經(jīng)EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切后，將目的基因VP60插入真核表達(dá)載體pVAX-1，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VP60。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pVAX1-VP60按500μg/只腿部肌肉注射25日齡家兔，同時(shí)設(shè)pVAX-

4、1組、兔瘟組織滅活苗組和PBS組。
　　于免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d對各組兔靜脈采血，使用ELISA法檢測血清中特異性抗體，PBS組和pVAX-1組未檢測到特異性抗體，pVAX1-VP60組和兔瘟組織滅活苗組家兔都能產(chǎn)生高水平的特異性抗體，在特異性抗體水平高峰期，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組血清抗體水平差異不顯著(p＞0.05）。在免疫后3d，7d，14d，21d，28d，35d，42d對pVAX1-VP60組隨機(jī)處死3只，