HPV6bL1重組質粒的構建及免疫原性分析.pdf

1、目的 間接免疫熒光技術在臨床與基礎研究中的應用較為廣泛，但卻極少有人用于尖銳濕疣的檢測，我們旨在驗證該方法是否可行，并將之與PCR方法相比較，以了解其準確性和敏感性。 材料和方法 60例臨床確診的尖銳濕疣疣體標本均取自性病門診，采取疣體印片，用小鼠抗人的HPV6型作為I抗，F(xiàn)ITC標記的山羊抗鼠IgG作為II抗，在熒光顯微鏡下檢查。剩余標本消化后做PCR，證實有無人乳頭瘤病毒（Human papillomavi

2、rus，HPV）的DNA，并用RFLP方法進行分型。 結果 34例尖銳濕疣標本中檢測到特異性熒光，陽性率為56.67％，而用PCR方法檢測到58例陽性，陽性率為96.67％。用X2檢驗比較二者的陽性率，P<0.01。主要感染類型為6和11型，占98.28％。 結論 間接免疫熒光技術針對的是HPV的衣殼蛋白，能檢測有完整衣殼的成熟HPV，操作簡便，有望用于宮頸涂片的常規(guī)檢查，以篩查HPV攜帶者，對預防宮頸癌

3、提供幫助。但敏感性不及PCR技術。 目的 尖銳濕疣是目前全球最常見的性傳播疾?。╯exually transmitted diseaseas,STD）之一，目前的治療方法復發(fā)率高，給患者帶來很大痛苦，經(jīng)濟上帶來沉重的負擔。HPV是尖銳濕疣的病原體，而北京地區(qū)又以HPV6 b為主。對HPV致病機理及機體免疫學的認識是疫苗研究的基礎。目前針對尖銳濕疣以預防性疫苗為主，主要引起機體的體液免疫，產生特異性抗體，以中和病毒。我們希

4、望構建一種可誘導機體細胞免疫和體液免疫功能、又制備工藝簡單的DNA疫苗。 材料與方法 第一階段：采用pcDNA3.1作為表達載體，將HPV6b的L1片段插入其中，在大腸桿菌中克隆擴增，并進行酶切及測序鑒定是否構建成功。第二階段：將構建成功的質粒pcDNA3.1-HPV6b L1轉染COS-7細胞，并分別用免疫熒光染色及蛋白免疫印跡驗證質粒能否在真核細胞內表達。第三階段：在此基礎上免疫BALB/c雌性小鼠，共分三組，每組六

5、只。第一組用pcDNA3.1-HPV6b L1免疫，第二組用pcDNA3.1-0，以上兩組每只小鼠肌注三次，每兩周一次，每次注射100μg，第三組不注射作為陰性對照。第三次免疫兩周后處死小鼠，取血及脾，檢測抗L1抗體滴度及脾淋巴細胞細胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ的分泌水平。 結果 第一階段：酶切出現(xiàn)目的片段，測序結果與預期插入的片段一致，證實pcDNA3.1-HPV6b L1已成功構建。第二階段：pcDNA3.1

6、-HPV6b L1轉染真核細胞24h后在胞核出現(xiàn)了陽性熒光信號；免疫印跡出現(xiàn)了陽性條帶，說明轉染成功，所構建質粒能在真核細胞內表達。第三階段：pcDNA3.1-HPV6b L1免疫小鼠后在血清內測到了L1抗體，抗體滴度在1：100以上。而空載體及陰性對照組均未檢測到。用L1蛋白刺激小鼠脾淋巴細胞只在pcDNA3.1-HPV6b L1免疫組出現(xiàn)了IL-4水平的明顯升高及IL-2、IFN-γ的微量升高，空載體及陰性對照組均未見升高。