雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pCN-SSIE的構(gòu)建及作為DNA疫苗的免疫原性檢測(cè).pdf

1、齲病是最常見(jiàn)的疾病之一，WHO2002～2003年度公布的最新資料顯示，雖然發(fā)達(dá)國(guó)家在近30年來(lái)齲病的發(fā)病率一直處于下降趨勢(shì)，但是在一些發(fā)展中國(guó)家，齲病仍呈上升趨勢(shì)，齲病的防治任務(wù)是非常艱巨的。研制一種高效廉價(jià)的防齲疫苗是較為符合當(dāng)前我國(guó)國(guó)情的一種防治方法。由于變形鏈球菌具有很強(qiáng)的向牙面粘附聚集和代謝糖分產(chǎn)酸耐酸的能力，它被認(rèn)為是最重要的致齲菌。變形鏈球菌的表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ(AgⅠ/Ⅱ)是其重要的毒力因子，在細(xì)菌向牙面粘附的過(guò)程中發(fā)揮

2、重要的作用。為了減少由于變形鏈球菌與人體存在交叉抗原而導(dǎo)致的疫苗的副作用，我們選擇了表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ上靠近N端的一段與粘附密切相關(guān)的多肽片段——唾液結(jié)合區(qū)段(Saliva-bindingregion，SBR)作為抗原。本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建含有編碼變形鏈球菌致齲毒力因子SBR基因的雙啟動(dòng)子防齲DNA疫苗pCN-SSIE，以減毒沙門(mén)氏菌為載體以誘導(dǎo)高效的粘膜免疫反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)中，我們首先通過(guò)PCR擴(kuò)增SBR基因和增強(qiáng)型綠色熒

3、光蛋白(enhencedgreenfluorescenceprotein，EGFP)基因，并利用PCR在兩段基因的兩端添加合適的酶切位點(diǎn)。利用定向克隆技術(shù)將SBR基因插入到雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pCMVnir中，然后在SBR基因上游5'端融合一段人工合成的tPA信號(hào)肽基因序列。SBR基因下游依次插入核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)(internalribozymeentrysite，IRES)基因和EGFP基因，構(gòu)建質(zhì)粒pCN-SSIE。通過(guò)DNA測(cè)序和酶

4、切分析證明雙啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒pCN-SSIE構(gòu)建成功后，再用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒沙門(mén)氏菌SL3261和轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，通過(guò)觀(guān)察綠色熒光標(biāo)記蛋白的表達(dá)和Western雜交方法檢測(cè)SBR蛋白在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的體外表達(dá)情況。用pCN-SSIE質(zhì)粒通過(guò)肌內(nèi)注射免疫小鼠，檢測(cè)其血清中的抗SBR特異性IgG抗體，以檢測(cè)質(zhì)粒在體內(nèi)的表達(dá)情況。最后利用攜帶質(zhì)粒pCN-SSIE的減毒沙門(mén)氏菌口服免疫小鼠，檢測(cè)小鼠血清和唾液中抗SBR的特異性抗體IgG和Ig

5、A的產(chǎn)生情況。 DNA測(cè)序和限制性核酸內(nèi)切酶酶切圖譜分析均證明，構(gòu)建的雙啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒pCN-SSIE插入序列正確，開(kāi)放讀碼框架無(wú)誤，質(zhì)粒構(gòu)建成功。在體外實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論在原核細(xì)菌和真核細(xì)胞中都觀(guān)測(cè)到了綠色熒光蛋白的表達(dá)，同時(shí)Western雜交也檢測(cè)到了SBR蛋白的表達(dá)，說(shuō)明質(zhì)粒在原核和真核細(xì)胞中都能正常表達(dá)。在肌注免疫小鼠的血清中檢測(cè)到了高水平的抗SBR特異IgG，說(shuō)明質(zhì)粒在體內(nèi)也能較好的表達(dá)，同時(shí)還具有良好的免疫原性。在以減毒沙