表達IL-21重組狂犬病病毒免疫原性研究.pdf

1、狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一種人獸共患傳染病，每年約有59000人死于狂犬病，我國是狂犬病高發(fā)國家之一?？袢∫坏┌l(fā)病其致死率幾乎為100％，疫苗接種是預防狂犬病的最有效方法。
　　狂犬病疫苗在免疫后可以通過T細胞依賴和T細胞非依賴的途徑激活B細胞免疫應答，從而激活機體產(chǎn)生中和抗體，預防狂犬病的發(fā)生。前期研究表明，白介素-21(Interleukin-21，IL-21)信號通路

2、缺失后對RABV免疫后的抗體誘導水平產(chǎn)生影響，提示IL-21在RABV的免疫原性中起到重要作用。因此，為了進一步探索IL-21在RABV的免疫原性中的作用機制，本研究擬通過反向遺傳操作構(gòu)建表達IL-21的重組RABV，并利用體外和體內(nèi)一系列實驗對該重組RABV進行研究:
　　首先，通過反向遺傳學操作系統(tǒng)拯救表達鼠源IL-21重組RABV，命名為LBNSE-IL21，通過ELISA檢測IL-21的體外表達情況，結(jié)果表明LBNSE-I

3、L21感染BSR細胞可以表達IL-21且具有劑量依賴性;此外，LBNSE-IL21在BSR細胞和NA細胞的生長曲線與親本毒株LBNSE幾乎一致，表明外源基因IL-21的插入對病毒的增殖沒有影響;在病毒致病性方面，將LBNSE-IL21腦內(nèi)注射小鼠后，小鼠無明顯臨床癥狀，且體重基本保持上升趨勢，與親本毒株LBNSE體重變化曲線相似，表明IL-21的表達對致病性沒有顯著影響。
　　進一步研究IL-21的表達對免疫原性的影響機制，LBN

4、SE-IL21和LBNSE感染Balb/c小鼠，利用流式細胞術(shù)檢測小鼠體液免疫應答中各類免疫細胞的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與LBNSE相比，LBNSE-IL21不能激活淋巴結(jié)或外周血液中的樹突狀細胞（dendritic cell，DC），但可以顯著提高淋巴結(jié)中濾泡性輔助細胞(follicular helper Tcells，Tfh)細胞和生發(fā)中心B細胞(germinal center B，GCB)數(shù)量，表明LBNSE-IL21免疫后表達的IL-2

5、1可以促進Tfh細胞和GC B細胞的生成，影響生發(fā)中心的發(fā)育。進一步研究發(fā)現(xiàn)，LBNSE-IL21可以促進B細胞向漿細胞（Plasma cells，PC）的分化，在骨髓產(chǎn)生更多數(shù)量的長壽命漿細胞(Long-lasting Plasma cells)，從而誘導產(chǎn)生高水平的中和抗體。
　　最后，為了探究LBNSE-IL21作為疫苗的免疫效果，將LBNSE-IL21和LBNSE免疫ICR小鼠，采集免疫后第1-7周的小鼠血清，利用FAVN

6、測定中和抗體效價。檢測結(jié)果顯示LBNSE-IL21在免疫后第1周便快速誘導機體產(chǎn)生中和抗體，并且第1-6周的抗體水平均顯著高于親本毒株LBNSE。這表明LBNSE-IL21免疫后可以更快誘導機體產(chǎn)生高水平的中和抗體。此外，在免疫后第三周，利用腦內(nèi)注射50 MICLD50的CVS-24對小鼠進行攻毒實驗，最終LBNSE-IL21免疫后可提供高達92％的保護率，顯著高于親本病毒免疫保護率68％。
　　綜上所述，LBNSE-IL21免疫