狂犬病毒街毒株DRV-AH08基因組序列測定分析及G蛋白免疫原性研究.pdf

1、狂犬病是一種古老的而又持續(xù)流行至今的自然疫源性疾病。由于其發(fā)病后100％的致死率，狂犬病在全球范圍內每年會奪走近5.5萬人的生命。中國是發(fā)病例數(shù)僅次于印度的狂犬病肆虐區(qū)，正在經(jīng)歷新中國成立以來的第三次狂犬病大流行，年均約2000～3000患者因此而喪生。
　　作為一種負鏈RNA病毒，狂犬病毒遺傳變異很快。國際病毒分類學委員會(ICTV)于2012年將全球的狂犬病毒屬分為RABV、LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、EBLV-

2、2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV、WCBV和HIBV共12個基因型，我國目前主要流行的為RABV狂犬病毒。
　　G蛋白是狂犬病毒的主要毒力決定因素。研究發(fā)現(xiàn)狂犬病毒弱毒株與街毒株致病性不同的主要原因之一是G蛋白的表達水平不同。
　　鑒于此，本研究針對2008年分離自中國安徽犬腦的一株狂犬病毒街毒株DRV-AH08進行基因組序列測定及系統(tǒng)進化分析，進一步研究該毒株與弱毒株ERA株G蛋白表達量、免疫原性和重組疫苗對小鼠

3、的免疫效果的差異。主要研究內容如下:
　　1、狂犬病毒街毒株DRV-AH08的分類鑒定及全基因組序列測定
　　RT-nestPCR擴增結果表明，DRV-AH08屬RABV狂犬病毒。據(jù)此，設計了10對引物完成了基因組序列的擴增及拼接，DRV-AH08GeneBank號:HQ450385。
　　2、DRV-AH08基因組結構及系統(tǒng)進化分析
　　DRV-AH08株基因組全長11924個核苷酸(nt)，基因組編碼基因如下

4、:N1353nt，P891nt，M609nt，G1575nt和L6384nt。DRV-AH08全基因組系統(tǒng)進化分析結果表明:世界范圍內基因Ⅰ型狂犬病毒屬可分為cladeⅠ、Ⅱ和Ⅲ3個進化分支，DRV-AH08屬于cladeⅠ。推導的G氨基酸序列分析表明:cladeⅠ和Ⅱ狂犬病毒起源于共同的祖先cladeⅢ，且cladeⅡ與cladeⅢ的親緣關系Ⅰ更近。分子鐘分析結果證實:cladeⅠ和Ⅱ狂犬病毒約于939～1536年前由cladeⅢ分化

5、而來，而cladeⅠ和Ⅱ約于195～670年前開始進化成不同的分支。
　　3、地域環(huán)境產(chǎn)生的選擇壓力會影響病毒進化
　　不同地域環(huán)境下的兩個優(yōu)勢毒株（DRV-AH08，ChinaⅠ，當前流行于中國;DRV-Mexico，D11，流行于墨西哥）氨基酸比對結果發(fā)現(xiàn)其N、G和L蛋白共存在17個氨基酸位點變異。推測這些變異與病毒的復制和毒力關聯(lián)很大，如當前中國狂犬病流行趨勢中病程縮短等。
　　4、不同毒力毒株G蛋白表達差異研究

6、
　　本研究以桿狀病毒為載體，構建了表達弱毒株ERA和街毒株DRV-AH08G蛋白的8個重組桿狀病毒。細胞轉導實驗表明:弱毒株G蛋白在昆蟲和哺乳動物細胞(BHK)中的表達量均高于街毒株;且弱毒株G蛋白生物學活性更好，在重組桿狀病毒上攜帶量更多。
　　5、DRV-AH08和ERA株G蛋白免疫原性研究
　　首先，我們以等量(1×108PFU)重組桿狀病毒免疫小鼠，一免、二免后表達弱毒株G蛋白的疫苗免疫組小鼠體內NA水平更高

7、;攻毒后體重變化更少，臨床癥狀更輕，存活率也更高:BAC-E1-E2(100％)＞BAC-E1-S2(90％)＞BAC-S1-E2(80％)＞BAC-S1-S2(66.7％)＞BAC-E1(60％)＞BAC-E2(40％)＞BAC-S2(10％)＞BAC-S1(0％)。繼而，我們以攜帶等量G蛋白的重組桿狀病毒BAC-E1(1×108PFU)和BAC-S1(2×108PFU)免疫小鼠，結果發(fā)現(xiàn)，BAC-S1免疫組小鼠仍無（一免后）或者僅有

8、很低的NA（二免后）產(chǎn)生，無法對小鼠產(chǎn)生有效保護（保護率0％）。該結果進一步證實:弱毒株G蛋白的免疫原性顯著優(yōu)于街毒株G蛋白。
　　同時，表達2個拷貝G基因的重組疫苗BAC-E1-E2能顯著提高疫苗的免疫效力，在低免疫劑量下即可對小鼠達到100％的免疫保護，可用于狂犬病的預防和控制。該策略也提示我們今后狂犬病疫苗的研發(fā):可通過同時插入多個免疫原性好的基因及趨化因子等進行共表達，以更好激發(fā)機體先天免疫及誘導特異性免疫，進而達到更理想