帶BAC質粒的重組偽狂犬病病毒的構建及其體外生長特性研究.pdf

1、偽狂犬?。≒seudoeabies，PRV）又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae）α亞科中的豬皰疹病毒Ⅰ（suiderpesvirusⅠ）所引起的豬、牛、羊等多種家畜及野生動物的一種以發(fā)熱、奇癢（除豬外）、腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病。尤其是豬偽狂犬病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。偽狂犬病毒基因組全長約150kb，可編碼70～100種蛋白，與α-皰疹病毒亞科的其它成員一樣，PRV具有潛伏感染和神經(jīng)

2、嗜性等α-皰疹病毒的典型特征。
　　 長期以來，基因缺失突變株的構建是研究皰疹病毒功能基因的主要策略，但在哺乳動物細胞中通過同源重組的方法構建基因缺失突變株是一項極為繁瑣的工作。1997年，德國學者Messerle等首次以細菌人工染色體（Bacterial Artificial Chromosomes，BAC）為基礎構建了鼠巨細胞病毒的感染性克隆。該技術允許病毒基因組以BAC質粒的形式在大腸桿菌中保存、增殖和遺傳修飾，并且操作簡

3、便、快速，極大地促進了皰疹病毒的功能基因研究，并為皰疹病毒高效載體系統(tǒng)的開發(fā)提供了新的途徑。
　　 本研究通過基因克隆技術以PRV弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作為同源臂，以及綠色熒光蛋白基因（EGFP）作為篩選標記構建了帶loxP位點的pUCTKAB-EGFP質粒，然后將pBeloBAC11線性化后插入到pUCTKAB-EGFP中構建了轉移載體pUCTK-EGFP-BAC11。將PRV基因組和轉移載體共轉染Ve

4、ro細胞，利用同源重組在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC質粒和綠色熒光蛋白篩選標記，經(jīng)過11輪噬斑純化和鑒定證實獲得了帶BAC質粒的重組偽狂犬病毒rv-PRVBAC。通過噬斑試驗和一步生長曲線測定等方法對重組偽狂犬病毒rv-PRVBAC的生長特性進行研究，結果發(fā)現(xiàn)帶有BAC質粒及篩選標記的重組病毒rv-PRVBAC在體外細胞培養(yǎng)中的增殖速度與親本毒Bartha K61株相比沒有明顯差別，說明大的基因片段的插入沒有影響重組病