RGD-重組蛛絲蛋白復合支架材料的研制.pdf

1、蜘蛛絲蛋白作為高性能的生物材料如人造肌腱、人工韌帶、人工器官、組織修復等組織工程新材料，具有十分誘人的應用前景。國外對蜘蛛絲蛋白作為組織工程材料的研究報道較少，國內以蜘蛛絲蛋白為材料制備組織工程材料除本課題組外也未見相關報道。 應用現代生物技術和高分子物理化學手段，將具有特定細胞粘附信號識別功能的RGD三肽的基因重組蛛絲蛋白pNSR16(分子量約為60kD)分別與生物相容性的高分子材料聚乙烯醇(PVA)、聚己內酯(PCL)復合，

2、充分發(fā)揮蛋白質和高分子材料兩方面的優(yōu)異性能，可以得到一類綜合性能優(yōu)良的組織工程新材料。為此，本研究采用冷凍干燥/粒子瀝濾法和靜電紡絲法制備了兩類4種重組蛛絲蛋白復合支架材料(pNSR16/PVA和pNSR16/PCL的多孔支架材料和納米纖維支架材料)，對重組蛛絲蛋白復合支架材料結構、理化性能進行分析，并對其生物學性能進行研究。 紅外光譜研究表明：甲酸使pNSR16分子構象進一步向無規(guī)卷曲方向轉變，飽和LiBr溶液則使其構象向β-

3、鏈方向轉變；加熱和變性都能促使pNSR16分子構象向β-鏈方向轉變；PVA和殼聚糖的加入，能明顯促進pNSR16分子構象由無規(guī)卷曲向β-鏈轉化。pNSR16/PCL支架材料的紅外光譜顯示：pNSR16和PCL可能只是以物理形式相結合。 力學性能測定表明：PVA可以改善pNSR16支架材料的力學性能：靜電紡絲可以提高復合支架材料的力學性能。 冷凍干燥/粒子瀝濾法制備pNSR16/PVA多孔支架材料的最佳制作配比和工藝是：采

4、用粒徑150-250μm的NaCl為致孔劑，pNSR16:PVA=100:4(w/w)，NaCl與pNSR16/PVA溶液按1:1(w/v)比例混合后倒膜，經-80℃冷凍干燥時間2小時10分鐘后，再用65-75％乙醇變性后洗滌除鹽。得到的pNSR16/PVA多孔支架材料孔隙均勻，孔徑在100-200μm之間，符合細胞生長的要求；且支架材料整體均勻，PVA與pNSR16相容性較好，未發(fā)生相分離現象。 靜電紡絲法制備粗細均勻的pNS

5、R16/PVA復合納米纖維的電紡過程參數是：電紡溫度45℃，紡絲液濃度15％、電紡電壓80kV、固化距離20cm、擠出速度5ml/h。掃描電鏡(SEM)結果表明：pNSR16/PVA復合納米纖維的直徑隨著紡絲液濃度、紡絲電壓、固化距離以及擠出速度的增大均呈現增大的趨勢；乙醇處理會引起復合納米纖維間產生明顯的粘連現象。 在pNSR16/PCL濃度為30％，NaCl的粒徑為150-250μm，NaCl相對于pNSR16/PCL溶液體

6、積的重量為1:1時，可以制得孔徑達100μm以上的pNSR16/PCL多孔支架，pNSR16/PCL多孔支架的孔徑已基本滿足常規(guī)細胞培養(yǎng)的要求，但pNSR16/PCL多孔支架的孔結構分布不是很均勻，孔的結構也不是完全相通的。 電紡過程參數控制在紡絲液濃度30％、電紡電壓80kV、固化距離20cm、擠出速度5ml/h的條件下，可以獲得粗細均勻的pNSR16/PCL復合納米纖維。當pNSR16與PCL的質量比為5:100、紡絲液濃度

7、為30％時，pNSR16/PCL復合納米纖維直徑隨著紡絲電壓的增大呈現減小的趨勢，當電紡電壓達90kV時，纖維直徑分布不均勻，纖維間有部分粘連；復合納米纖維直徑隨著固化距離增大也呈現減小的趨勢，復合納米纖維直徑隨著擠出速度增大呈現增大的趨勢，同時纖維變得不均勻。 pNSR16/PVA多孔支架在PBS磷酸鹽緩沖液和含有彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶的PBS磷酸鹽緩沖液中的降解行為初步證實了pNSR16/PVA多孔支架具有生物

8、可降解性，說明可以通過改變pNSR16與PVA的混合比例來調節(jié)支架的降解速度。pNSR16/PVA支架材料浸提液的細胞毒性反應為1級、符合生物材料的合格標準；鼠成纖維細胞NIH-3T3和人類結腸腺癌細胞Caco-2與pNSR16/PVA多孔支架材料的體外聯合培養(yǎng)結果表明：pNSR16/PVA多孔支架具有良好的細胞相容性，有利于細胞的粘附和生長。 pNSR16/PVA復合納米纖維的孔隙率、吸濕性、滲出液在纖維間和纖維內的分布比值

9、、溶漲率分別為84.85％、4.381 g/g、6.140 g/g，pNSR16/PCL復合納米纖維的相應指標為86.47％、4.794 g/g、14.58 g/g，均比多孔支架有明顯的增加，表明靜電紡絲技術可以有效提高pNSR16/PVA支架作為生物敷料的相關性能指標。 pNSR16/PCL復合支架材料的毒性等級在1級以下、符合生物材料的合格標準；pNSR16/PCL復合支架材料的毒性小于純PCL支架材料，說明pNSR16能