RGD-重組蛛絲蛋白-聚己內(nèi)酯復(fù)合支架材料的研究.pdf

1、聚己內(nèi)酯(PCL)是一種新型脂肪族聚酯，以其良好的機(jī)械性能、無毒性、可塑性等優(yōu)良性能廣泛應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域，但材料表面缺乏細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞的親和力不夠，植入體內(nèi)會(huì)引起炎癥反應(yīng)等成為制約其作為理想組織工程材料的主要障礙。蛛絲蛋白纖維作為高性能生物材料具有十分誘人的應(yīng)用前景。國(guó)外對(duì)蛛絲蛋白作為生物材料的研究報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)以蛛絲蛋白為材料制備組織工程生物材料除本課題組外尚未見相關(guān)報(bào)道。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)和高分子物理化學(xué)手段將具有特定細(xì)胞黏附

2、信號(hào)識(shí)別功能的RGD三肽的基因重組蛛絲蛋白pNSR16與PCL共混，充分發(fā)揮蛋白質(zhì)和高分子材料兩方面的優(yōu)異性能。采用冷凍干燥/粒子濾粒法和靜電紡絲技術(shù)制備pNSR16/PCL復(fù)合多孔支架和納米纖維支架，對(duì)復(fù)合支架材料結(jié)構(gòu)、理化性能進(jìn)行分析，并對(duì)其降解性能和生物學(xué)性能進(jìn)行研究，得到一類綜合性能優(yōu)良的組織工程新材料。 冷凍干燥/粒子濾粒法制備pNSR16/PCL多孔支架材料的最佳制作配比和工藝是：溶液濃度0.3g/mL、致孔劑NaC

3、l用量0.5g、粒徑為150-250μ m，可以制得孔徑達(dá)到100μ m以上pNSR16/PCL多孔支架，支架孔徑能基本滿足常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的要求；電紡過程參數(shù)控制紡絲液濃度30％、電壓80kV、固化距離20cm、擠出速度5ml/h條件下可獲得粗細(xì)均勻的pNSR16/PCL復(fù)合納米纖維。 掃描電鏡(SEM)觀察到添加pNSR16不影響PCL支架材料的表面形貌。傅立葉紅外光譜分析表明pNSR16與PCL以物理方式共混，二者之間并未形成

4、新化學(xué)鍵。熱性能測(cè)試結(jié)果表明66.5℃為支架材料的熔點(diǎn)(或軟化點(diǎn))，416.7℃對(duì)應(yīng)為熱分解溫度，添加pNSR16并未影響PCL的熱性能。力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果表明，多孔支架制作過程中致孔劑的加入提高了支架材料的力學(xué)性能，靜電紡絲可明顯提高支架材料的力學(xué)性能。對(duì)多孔支架及納米纖維支架的孔隙率和吸濕性進(jìn)行測(cè)試比較發(fā)現(xiàn)，靜電紡納米纖維膜的孔隙率平均達(dá)90％，吸濕性達(dá)3.0g/g以上，而澆注多孔膜孔隙率平均僅達(dá)到81％，吸濕性僅1.5 g/g，電紡

5、絲技術(shù)可以有效的提高pNSR16/PCL復(fù)合膜作為生物敷料的相關(guān)性能指標(biāo)。選擇磷酸鹽溶液、含豬胰脂肪酶的磷酸鹽溶液，通過殘余重量百分比及SEM考察pNSR16/PCL復(fù)合支架的體外降解行為。結(jié)果表明由于蛋白脫落造成孔隙空間大，pNSR16/PCL復(fù)合支架材料的降解速度較PCL快。另外，支架材料的降解與材料的大小及表面積有關(guān)，纖維膜降解速度較多孔膜快。說明pNSR16/PCL復(fù)合支架具有一定的生物可降解性。 評(píng)價(jià)pNSR16/PC

6、L復(fù)合支架的細(xì)胞相容性，采用MTT的方法考察支架材料的細(xì)胞毒性，并通過NIH-3T3細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)考察其對(duì)細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和分化的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與單純PCL浸提液相比，pNSR16/PCL復(fù)合材料浸提液能較明顯促進(jìn)NIH-3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，且效果隨著pNsR16比例的增大而越好，根據(jù)細(xì)胞毒性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，分析pNSR16/PCL復(fù)合支架材料毒性等級(jí)在1級(jí)以下，符合生物材料的要求。SEM和常規(guī)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，pNSR16

7、/PCL復(fù)合支架更利于NIH-3T3細(xì)胞黏附，細(xì)胞在材料表面增殖形成多層結(jié)構(gòu)。細(xì)胞在納米纖維膜上生長(zhǎng)呈現(xiàn)一定的方向性，但是基本停留在膜表面生長(zhǎng)，并未見伸入膜孔隙內(nèi)部，而在澆注多孔膜上不僅在表面大量擴(kuò)增，且逐漸伸入孔隙內(nèi)部。細(xì)胞支架粘附率及增殖曲線測(cè)定結(jié)果表明，pNSR16/PCL復(fù)合支架的細(xì)胞粘附率明顯高于PCL支架，pNSR16/PCL復(fù)合納米纖維膜高于pNSR16/PCL復(fù)合澆注多孔膜。細(xì)胞在各組支架上均能正常增殖，在PCL材料上增

8、殖速度較慢，在pNSR16/PCL復(fù)合納米纖維膜上剛開始增殖較快，以后則因?yàn)榭臻g限制細(xì)胞增殖速率較多孔膜慢。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明NIH-3T3細(xì)胞在各組支架上均可正常表達(dá)bFGF因子。說明RGD-重組蛛絲蛋白明顯改善了PCL材料的細(xì)胞相容性，該復(fù)合材料具備種子細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的微環(huán)境，初步認(rèn)為可進(jìn)一步應(yīng)用于組織工程各領(lǐng)域。 以醫(yī)用膠原為對(duì)照，將各組支架材料植入SD大鼠肌肉，觀察機(jī)體的炎癥反應(yīng)和材料在體內(nèi)的變化。pNSR16/PCL